甲型肝炎(简称“甲肝”)是由甲型肝炎病毒(hepatitis A virus,HAV)引起的一种急性传染病,主要经粪-口途径传播,四季均可发生.甲肝容易发生大规模的暴发,其流行程度因世界各地不同的卫生条件、社会经济水平而存在着显著差异[1].目前,世界范围内使用最多的甲肝疫苗为甲醛灭活疫苗和减毒活疫苗,两种甲肝疫苗均有良好的接种效果[2].本文就甲肝疫苗的研究现状、HAV分子的最新发现及对新型疫苗的研究进展予以综述.
甲型肝炎是由甲型肝炎病毒引起的,以肝实质细胞炎性损伤为主的世界性传染病,各国的甲肝抗体水平差异明显.1992年全国开展了病毒性肝炎的血清流行病学研究,至今已十余年,为及时掌握甲肝抗体各地区、年龄组等分布情况,与1992年流调结果相比较,找出变化规律,提出甲肝预防策略,2001年我们对浙江省人群甲肝流行情况进行分析,现将结果报告如下.
我国是甲型肝炎病毒的高流行区,其发病率占各型病毒性肝炎的首位.青少年由于其活动范围大,卫生意识薄弱,是甲肝的易感人群.甲肝疫苗做为主动预防甲肝的有效手段,近年来被人们广泛应用.
在美国最常检出的病毒性肝炎病毒有3种,它们是甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV).这3种互不相关的病毒都能引起急性疾病,其特点为恶心、不适、下腹痛和黄疸,还可引起慢性感染,增大发生慢性肝炎和肝癌的危险.
甲型肝炎病毒(HAV)是小RNA病毒,主要经粪-口途径传播.人感染HAV后,可表现为临床型和亚临床型感染.6岁以下儿童感染HAV后,70%为亚临床型感染;大龄儿童和成人感染HAV后,70%以上为临床型感染,病死率为0.3%～0.6%;50岁以上患者的病死率为1.8%;慢性肝病者感染HAV后,发生急性肝衰竭的危险性升高[1].甲型肝炎的的流行情况与社会、经济状况和卫生水平密切相关,随着生活条件的改善,幼年时感染HAV的人数减少,而成年人感染HAV人数增多,临床型甲型肝炎比例上升,从而甲型肝炎成为较严重的公共卫生问题.
为了探讨氯灭活甲型肝炎病毒(HAV) 的机制,采用酶联免疫吸附试验和RNA的随机引物扩增指纹图谱技术分别检测在氯灭活HAV前后病毒抗原以及核酸多态性的变化.结果显示:灭活病毒的感染性(加氯10mg/L或20mg/L接触30min)先于破坏病毒的抗原性(加氯10mg /L或20mg/L接触60min),当病毒感染性被灭活时,往往可以看到病毒核酸多态性的变化.结果表明:氯灭活HAV可能是通过破坏核酸局部片段所致.
目的 建立果蔬生产用水中甲型肝炎病毒(HAV)的检测方法和质量控制标准体系.方法 在水样中添加2.5×109pfu/mL的质控物质大肠杆菌噬菌体MS2100 μL,采用正电荷滤膜法捕获病毒,并根据大肠杆菌噬菌体MS2的标准曲线计算出病毒回收效率,实时荧光RT-PCR检测水样中甲肝病毒,并建立质量控制标准体系.结果 对6个水质样品同时加入HAV和大肠杆菌噬菌体MS2并进行病毒回收率的比较,HAV回收率为1.24％～ 32.68％,MS2回收率为1.64％～ 14.24％,达到了ISO/TS 15216-2-2013对病毒回收率＞1％的要求.同时对30个实际水质样品进行HAV检测,1个样品检出HAV,质控物质大肠杆菌噬菌体MS2提取回收率为1.24％～24.19％,标准偏差为0.0612.结论 所建立的水样中病毒检测质量控制体系保证了检测结果质量.
目的:建立一种快速、简便、灵敏的检测贝类中甲型肝炎病毒RT-PCR方法,能够有效防止甲肝病毒的传播和对口岸进口贝类产品的监控.方法:通过对病毒富集的3种方法(大体系PEG8000、小体系PEG6000和小体系PEG8000富集法)、提取RNA的2种方法(Trizol法和试剂盒法)以及RT-PCR检测的2种方法(一步法和两步法)进行比较,确立一种快速检测贝类中甲肝病毒的RT-PCR方法.结果:经比较,采用小体系肠道样本检测比采用全贝检测的富集效果更佳,并比较了小体系PEG8000与PEG6000和大体系PEG8000对病毒富集的效果,回收率分别为13.3%、7.5%、10.0%;对HAV总RNA的2种提取方法进行了比较,结果均获得了纯度较高、完整性较好的总RNA,以此为模板采用一步法和两步法进行反转录和PCR反应.经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定,从人工污染的阳性样本中扩增得到一段长度为192bp的特异PCR扩增产物.应用本研究建立的RT-PCR方法对大连地区85份贝类及产品进行HAV检测,结果未显阳性,说明样本中不含HAV.整体用时仅为5h.结论:本研究建立的检测HAV的RT-PCR方法灵敏特异、操作时间短,该方法可对贝类及其产品进行确实有效的HAV的检测.
为了解氯灭活HAV与HAV核酸变化的关系,采用大片段逐步步移RT-PCR技术对HAV核酸全序列进行扫描.结果,在25℃以10 mg/L有效氯作用30 min,可完全灭活HAV,而5 mg/L有效氯作用60 min则不能.在HAV核酸全序列中,各部分对氯的抗力不一,以5＇NTR最为敏感,用10mg/L有效氯作用30 min,检测其为阴性;其次为3＇NTR,当10 mg/L有效氯作用60 min时,亦为阴性;结构区的某些片段对氯的抗力较强.以10 mg/L有效氯作用30 min,进一步缩小氯对HAV核酸作用敏感区间(即近5＇NTR)的检测发现,病毒最初的1～671 bp检测呈阴性,而669～1023 bp仍呈阳性.结果表明,氯灭活HAV与其核酸5＇NTR的损伤一致,在充分了解氯对HAV作用机理的基础上,PCR可用于消毒效果的评价.
我国是世界上病毒性肝炎的高发区,甲、乙、丙、丁、戊型肝炎在我国均有流行.据1992～1995年全国肝炎血清流行病学调查结果,我国人群甲型肝炎病毒感染率为80.9%;乙型肝炎病毒感染率为57.6%;乙型肝炎病毒携带率为9.8%,其中1.2%同时感染乙型和丁型肝炎病毒;戊型肝炎病毒感染率18%.据此推算,我国约9.7亿人已感染过甲肝病毒,6.9亿人已感染过乙肝病毒(其中1.2亿人为携带者),140万人感染过丁型肝炎,至少2.1亿人已感染过戊型肝炎病毒.在我国法定的传染病报告中,病毒性肝炎的发病率和死亡率均居首位,平均发病率为100/10万左右,即全国每年发生急性病毒性肝炎约120万例.另据调查,我国现患的慢性肝炎病人约2 000万例,每年死于肝病的超过30万例,其中50%以上为原发性肝细胞癌,且绝大多数与乙型和丙型肝炎病毒感染有关.
幽门螺杆菌(Hp)的发现已有近20年的历史,Hp感染传播的具体途径尚不清楚,一般认为有粪-口途径和口-口途径.甲型肝炎病毒(HAV)感染是经粪-口途径传播的病毒性疾病,研究Hp感染与HAV的一致性有助于判断Hp感染传播的途径.因此我们对河北省遵化市下府村进行了Hp感染与HAV感染的一致性调查.
近年来，聚合酶链式反应(PCR)技术由于特异性强、操作简便已广泛用于环境中肠道病毒的检测。常规PCR 1次只能检测1种病毒，而水中病毒有多种，因而不能满足实际应用的需要。Tsai等［1］用多重PCR1次检测脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒和轮状病毒3种病毒，这种方法需要引物较多，引物之间易相互干扰，检测3种以上病毒就比较困难。Zoll等［2］采用通用引物PCR技术检测肠道病毒，但是这种方法只能证明有无肠道病毒的存在，不能鉴别病毒种类。我们首次将通用引物PCR和多重PCR相结合用于肠道病毒检测，兼顾了两者的优点，克服了各自的不足。
答:病毒性甲型肝炎(甲肝)是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的传染病,妊娠妇女感染甲肝的机会与普通人相似.中医在抗病毒与保胎方面具有一定优势,治疗需注意如下几个方面.
为了解2005年新疆伊犁甲型肝炎病毒(甲肝病毒)流行株分子流行病学特征,收集了部分甲肝病人血清标本,用国际上通用的甲肝病毒结构区基因VP1-2A分型引物,经核酸提取,做RT-PCR,序列测定,对甲肝病毒基因进行分型研究,并对甲肝病毒在甲型肝炎(甲肝)病人血清中存在的时间进行了探讨.结果显示,甲肝病毒核苷酸序列变异在0～3.2%之间,分为不同的基因簇,但都属于1A亚型(同一基因亚型间核苷酸序列变异小于7.5%);氨基酸序列几乎相同.甲肝发病8周后的病人血清中仍能检测到甲肝病毒.结果说明该流行区有多株甲肝病毒存在,其传染源可能有多个传播途径,当人群免疫水平较低时,可引起甲肝流行.甲肝病毒在病人血液中可存在较长时间.这些工作为今后进一步开展甲肝病毒溯源研究及有效控制甲肝病毒流行提供了理论和技术支撑.
为了探讨人源抗甲型肝炎(甲肝)病毒scFv-Fc融合抗体在酵母中的表达特性,将获得的人源抗甲肝病毒中和性单链可变区抗体(scFv抗体)基因克隆入含信号肽及人IgG1Fc抗体基因的酵母细胞表达载体中,获得了一株中和性人源抗甲肝病毒pPiscFv-FcHA16融合抗体的分泌表达,并对表达产物进行了纯化.同时对表达产物的生物学特性进行了一系列鉴定.表达的pPiscFv-FcHA16融合抗体为具有不同糖基化形式的同源二聚体,与相应的CHO细胞表达的IgG抗体相比,pPiscFv-FcHA16融合抗体仍保持很好的抗原结合活性,以及与中和性鼠抗甲肝病毒单克隆抗体的竞争抑制能力.同时也保持了对甲肝病毒的体外中和活性.这些结果表明,在酵母中表达的单链可变区(scFv)与IgG1Fc区的融合抗体具有很好的生物学活性,有希望用做体外诊断,用纯化相应的抗原,或者可能用于体内预防与治疗.
将HAV IgM-Ab诊断试剂盒用HAV-Ag标准品调控灵敏度后,用于检测HAV-Ag,并比较快速检测法和常规过夜法两种检测方法的测定效果,以选择在甲肝疫苗生产中,抗原检测的合适方法.经过调控灵敏度后,抗HAV IgM诊断试剂盒完全可以用来检测HAV-Ag.并可以正确评价HAV-Ag滴度,HAV感染性滴度.适用于甲肝疫苗的检定工作.
目的 测定甲型肝炎(甲肝)减毒活疫苗H2减毒株P2区基因序列,了解其减毒和细胞适应的分子机制.方法 通过逆转录-聚合酶链反应,特异扩增甲肝减毒活疫苗H2株成品疫苗及其亲本毒种P2区VP1/2A、2B、2C基因序列,经测序、比对,分析检测毒力基因VP1/2A、2C的变异情况.结果 甲肝减毒活疫苗H2成品疫苗及其亲本毒种毒力基因VP1/2A、2C区毒力相关基因簇均为减毒型特征.结论 甲肝减毒活疫苗H2减毒株毒力基因VP1/2A、2C均为减毒型特征,且遗传稳定性良好.
目的 了解辽宁省东港市2014年甲型肝炎(甲肝)病毒(Hepatitis A Virus,HAV)流行株基因型特征,为HAV溯源研究奠定基础.方法 收集东港市部分甲肝病人血清标本,HAV结构-非结构区基因VP1-2A引物,经核酸提取,逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR),序列测定,对HAV基因进行序列同源性及亲缘关系分析.结果 本次检测到的东港市HAV都属于1A亚型,核苷酸序列同源性为98.1％～100％,与中国河北省、日本及韩国的流行株VP1-2A编码区基因有相同序列或同源性较高.结论 东港市有多株HAV存在,流行可能有多个传染链,在人群免疫水平较低时,引起甲肝流行.
目的 分析中国部分甲型肝炎(甲肝)病毒(Hepatitis A Virus,HAV)流行株结构蛋白VP3～VP1编码区核苷酸及氨基酸序列特点,并比较与甲肝减毒活疫苗(Hepatitis A Attenuated Live Vaccine,HepA-L)标本序列差别.方法 收集39份甲肝病例急性期血清样本及2份市售HepA-L标本,经核酸提取、逆转录及巢式聚合酶链反应,测得结构-非结构蛋白VP3～VP1-2A编码区序列,进行基因亲缘关系、氨基酸序列同源性等分析.结果 检测到的部分HAV流行株序列均为IA亚型,其在结构-非结构蛋白VP3 ～ VP1-2A编码区核苷酸和氨基酸序列同源性分别为94.8％～ 100％和99.3％～ 100％,与检测的2份HepA-L标本的核苷酸和氨基酸序列同源性为90.6％ ～ 91.9％和99.1％～99.4％.其中的1条序列在VP3-56位,发生丝氨酸(Serine,Ser)→脯氨酸(Proline,Pro)替代;3条序列在VP1-112位,发生苏氨酸(Threonine,Thr)→异亮氨酸(Isoleucine,Ile)替代,靠近中和抗原位点VP1-114位;所有序列在已发表的中和抗原位点处氨基酸无变化.选择压力分析表明,检测到的部分HAV流行株序列在VP3～ VP1编码区处于负向选择.检测的2份HepA-L标本序列均为IB亚型,在已发表的中和抗原位点处氨基酸无变化.结论 HAV的结构蛋白编码区核苷酸序列存在一定差异,但其氨基酸序列相对保守.检测到的3条HAV流行株序列在中和抗原位点附近发生氨基酸替代,值得进一步研究.
甲型肝炎(甲肝)灭活疫苗(Hepatitis A Inactivated Vaccine HepA)于1995年在美国上市,并获准用于≥2岁人群甲肝病毒(Hepatitis A Virus HAV)暴露前免疫,美国食品和药品管理局(FDA)于2005年批准HepA可用于12～23月龄儿童.美国免疫实施咨询委员会(ACIP)分别于1996、1999、2006年三次发表暴露前使用HepA的建议.H前建议HepA用于12～23月龄儿童和高危人群的预防接种,以及部分地区大龄儿童的补种.
展望中国控制甲型肝炎(甲肝)之前景,考虑与甲肝流行相关的几个问题:甲肝病毒(HAV)的致病特点;HAV经粪-口途径传播及人群抗体水平状况.控制甲肝流行的有利因素:HAV的基因结构稳定;绝大多数人HAV可归于I型,株间核苷酸差异＜15%,且HAV只有1个血清型,中和抗体可以中和不同基因型的HAV;中国控制甲肝已取得显著的效果,甲肝减毒活疫苗的研究、开发与应用10余年取得了显著的成就.在理论上甲肝是一种可用疫苗消灭的疾病,中国应为此做出贡献.
人类肠道病毒（EVs）是小 RNA 病毒科下的一属病毒，通常在夏秋季节爆发流行。在肠道病毒中，目前只有脊髓灰质炎病毒（PV1-3）、甲型肝炎病毒（HAV）和肠道病毒71型（EV71）有相应的疫苗[1]，仍有超过110种的肠道病毒对人类健康造成巨大威胁。这些病毒最常造成的危害是呼吸道和消化道的轻度症状，但同时它们也是造成无菌性脑膜炎和心肌炎的常见元凶。肠道病毒造成的疾病多种多样，且同一种、同一型病毒的感染所造成的危害程度也不尽相同，从轻度症状到严重临床疾病的发展过程也是难以预知的。例如肠道病毒71型以及柯萨奇病毒 A16型（CVA16）引起的手足口病，大多数病例都可康复，但少数患者则会发展为脑干脑炎、肺水肿或其他致命症状[2-3]。
水样中甲型肝炎(HAV)的检测一直是难以解决的问题,其关键在于是否有简单的方法使浓缩后的水样中病毒含量较多,达到灵敏、特异的PCR技术能够检测出的水平.
甲型肝炎是我国主要传染病之一,经粪-口途径传播.甲型肝炎病毒(HAV)在组织培养中生长缓慢,滴度低,限制了甲型肝炎疫苗及诊断试剂的生产.因此有必要克隆我国自己的HAV基因,为体外表达HAV抗原打下基础.HAV属小RNA病毒科肝病毒属,为无包膜的单链RNA病毒,含有长约7.5 kb的正链RNA,5′端有长的非编码区,3′端有polyA的尾巴.基因组含有一个长的开放读码框架,编码2 227个氨基酸的大蛋白.基因排列顺序为:5′-NCR-VP4-VP2-VP3-VP1-2A-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′NCR,其中VP4至VP1为结构蛋白区又称P1区,2A至3D为非结构蛋白区,又称P2(2A-2C),P3(3A-3D)区.HAV只有一个血清型,结构蛋白抗原具有构型依赖性,抗原序列相对保守.其中5′NCR、2B、2C、3A及3′NCR区对细胞培养株的适应性有关,3C为蛋白酶区,几乎切割多蛋白的所有位点,3D为RNA聚合酶区[1].我们对我国HAV龙甲株全序列的cDNA克隆及序列进行了分析,并与HM175株[2]和MBB株[3]以及已发表的甲肝病毒龙甲株结构区基因[4]进行了比较.
一般认为，甲型肝炎病毒(HAV)感染在发展中国家多发生在幼儿和儿童期，多为亚临床型，不易被发现，病死率也较低〔1，2〕。现将我科1990～1999年收治的9例由HAV感染引起的儿童重型肝炎分析如下。1 一般情况 1990～1999年共收治甲型肝炎875例，其中甲、乙型肝炎病毒双重感染78例。诊断为重型肝炎9例，5例死亡，病死率为55.6%，在同期甲型肝炎中病死率为0.57%。其中急性重型肝炎2例(22.2%)，全部死亡，病死率为100%；亚急性重型肝炎7例(77.8%)，3例死亡，病死率为42.9%；9例中1例(11.1%)重叠HBV感染并死亡。患儿年龄1～10岁，平均年龄6岁；5岁以下5例(55.6%)。7例男孩(77.8%)，男：女为3.5∶1。重型肝炎的诊断标准按照1995年5月北京第五次全国传染病寄生虫病学术会议修订的病毒性肝炎防治方案的标准。肝昏迷按Ⅳ度分法。分析各相关因素对病死率的影响结果用t检验。
目前已有用于接触前预防的甲肝疫苗,但对于接触后预防,则多采用特异性免疫球蛋白作被动免疫.血源性免疫球蛋白虽应用效果好,但可能被血源中难以检测的病原体污染;鼠源抗体易引起人抗鼠抗体反应.因此基因工程人源抗体有望成为接触后预防的首选制剂.本文在从噬菌体抗体库筛选的抗甲型肝炎病毒(HAV)人源抗体的基础上,选用大肠杆菌高效表达该抗体Fab,并对表达产物进行了复性.
目的了解甲型肝炎病毒中国流行株5′非编码区(5′ NCR)核苷酸序列的异质性. 方法选择浙江、江苏、安徽、云南等地的甲肝病人粪便或血清标本,以逆转录-套式聚合酶链反应(RT-nPCR),扩增合成5′ NCR高变区基因片段,并进行直接核苷酸序列分析和差异比较. 结果所有甲型肝炎病毒株间5′ NCR高变区核苷酸差异≤3nt;与美国株LA差异≥4nt;与澳大利亚株HM175差异≥11nt;差异的大小与基因型无关. 结论甲肝病毒基因结构非常稳定,变异率极低.
目的对甲型肝炎病毒吕8株第25代细胞适应株的部分基因序列作基因克隆分析. 方法采用逆转录聚合酶链反应法从细胞培养产物中克隆病毒并进行核苷酸序列分析. 结果吕8株与HM175/7MK-5的核苷酸/氨基酸同源性最高为98%/96%,基因型属于ⅠB 亚型. 结论吕8株与中国地区以前报道的大多数甲肝病毒株有较大差异,进一步证明了在中国除了ⅠA亚型外还存在其它基因型的甲肝流行.
目的 构建人噬菌体抗体组合文库,筛选人单克隆抗体.方法 用RT-PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,电转化E.coli形成噬菌体抗体库;以固相化抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体.结果 17对免疫球蛋白引物全部能够扩增出目的片段;经数次电转化构建了库容为6.93×107的抗体库,滴度为8×1014 PFU/ml,Fab基因重组率为40%.以单抗捕获的甲肝抗原淘洗3轮,出现特异性富集;阳性克隆经直接ELISA和竞争抑制性ELISA实验证实具有良好的抗甲肝抗原特异性,无交叉反应性.结论 成功构建了抗体组合文库,从中获得抗甲肝抗原的特异性人抗体.
甲型肝炎是一种由甲型肝炎病毒引起的肠道传染病,是丹东市传染病构成中发病率较高的病种之一,严重影响了丹东市人民群众的身体健康和社会经济发展.为有效控制甲型肝炎的流行,笔者根据丹东市1981～2004年的疫情资料,统计分析了甲型肝炎的流行特征,现报告如下.
