最近有报道在肺炎链球菌发现HtrA(high-temperature requirement A)蛋白,与细菌克服高温、氧化和渗透压力有关.肠球菌原来属于D组链球菌,其许多特性与链球菌相似.肠球菌能否产生HtrA蛋白酶以及确切的功能目前尚不清楚.我们利用BLAST将肺炎链球菌HtrA蛋白酶编码基因与粪肠球菌染色体基因组进行同源性比较,发现粪肠球菌有一个全长为851 bp的开放性读框与肺炎链球菌htrA基因有较高的同源性.进一步从基因文库查找此开放性读框,发现它是编码粪肠球菌假定的丝氨酸蛋白酶基因,被命名为sprE.为了研究sprE基因的确切功能,利用基因敲除构建粪肠球菌sprE基因突变菌株,在不改变该细菌其它遗传性状的基础上,研究sprE基因在粪肠球菌抗高温和氧化作用.
近年来,大肠埃希菌对环丙沙星的耐药率上升明显,其对喹诺酮类药物耐药性的产生主要与染色体gyrA基因突变有关[1],而它的突变过程是渐进的,即首先发生单基因位点突变,此时菌株对环丙沙星仅表现为敏感性下降.如在药物继续作用下,则极易发生双基因或多基因位点突变[2],表现为高度耐药.如能检出单基因位点突变菌株对防止大肠埃希菌演变成耐药菌有重要临床意义.目前检测gyrA基因突变均采用分子生物学方法,如聚合酶链反应(PCR)、基因测序等,无法作为常规方法.为此,我们用萘啶酸预测gyrA基因突变进行了探讨,现报告如下.一、材料与方法1.菌株:从病房和门诊病人送检标本分离63株临床菌株,其中对萘啶酸、环丙沙星均敏感24株;萘啶酸耐药、环丙沙星敏感或低水平耐药17株;萘啶酸、环丙沙星均耐药22株.1株标准菌株为大肠埃希菌ATCC25922,萘啶酸、环丙沙星均敏感.2.药敏采用纸片扩散(K-B)法:药敏纸片、M-H培养基均为OXOID产品.药敏结果按美国临床实验室标准化委员会1999年标准判断.3.基因检测:PCR扩增,喹诺酮类耐药决定区(QRDR)引物按文献[3],引物1为5′-GAGGAAGAGCTGAAGAGCTCCT-3′,引物2为5′-CCGGTACGGTAAGCTTCTTCAA-3′,由中国军事医学科学院合成;Hinf
随着细菌耐药现象越来越严重,人们对细菌耐药机制的研究越深入,但主要集中在如何延缓获得性耐药的传播.Dong等[1]1999年提出的防突变浓度(mutant prevention concentration,MPC)和突变选择窗(mutant selection window)的概念,则是用于体外判定药物是否可能导致病原菌产生自发耐药,为研究耐药机制开辟了新的领域.我们通过测定氟喹诺酮类药物单用及与头孢唑林联用对金黄色葡萄球菌ATCC29213株的最低抑菌浓度(MIC)MIC99和MPC,探讨联合用药对细菌突变选择窗的影响,寻找减少耐药突变菌株产生的新途径.
2011年Keystone Symposium结核病国际研讨会于201 1年1月15-20日在加拿大温哥华举行.笔者将会议的主要内容概述如下.1.结核病免疫学研究:微小RNA通过调节细胞因子和化学因子的效应而在先天免疫中发挥作用,本次会议上有研究者报道,在分析MTB感染巨噬细胞过程中微小RNA的表达谱时,发现微小RNA-155显著增高.另有研究者介绍了白细胞介素-12p40同源二聚体在介导树突状细胞和T细胞活化的新功能,当MTB入侵免疫系统时,活化和记忆T细胞迁移到病灶周围的过程相对较慢,如果能促进这一过程,就能改善现有的疫苗设计.以往认为,分枝杆菌的特点是定位于宿主细胞的吞噬体内,现在这种认识受到挑战.有研究者在细胞质内发现分枝杆菌的存在,但这种迁移只存在于致病性分枝杆菌中,尚未在非致病性分枝杆菌及其突变菌株中发现这种现象,其意义在于,将MTBⅦ分泌家族分泌系统导入卡介苗中,可使卡介苗获得迁移至细胞质中的能力.
近年来,大量广谱抗生素的过量使用甚至滥用造成了选择性压力,细菌为适应生存环境可发生突变(包括核苷酸缺失、替换或插入),当突变菌株具备生存优势,可在有抗生素的环境下生存,即对该抗生素产生耐药.耐药基因可由染色体编码,也可由质粒介导,耐药基因可垂直传给子代;更重要的是抗生素耐药基因可在不同细菌菌种间、属间进行水平传播.多个耐药质粒或染色体的基因盒还可组装在一起,产生多重耐药菌,给临床治疗带来重重困难.当前,细菌耐药趋势日益严重成为全球关注的焦点,备受关注的有产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)和染色体介导的Ⅰ类β-内酰胺酶(AmpC诱导酶)的革兰阴性杆菌;耐甲氧西林葡萄球菌(MRS), 耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)和耐万古霉素的肠球菌(VRE)等革兰阳性球菌,都给临床治疗感染带来麻烦.
作者构建了鼠伤寒沙门菌肠毒素（stn）基因插入失活型与缺失型突变的重组自杀载体质粒，通过重组自杀质粒中的突变stn基因与鼠伤寒沙门菌株2000染色体上野生型stn基因发生同源交换，筛选获得stn基因突变的同源突变菌株。在小鼠体内检测菌株stn基因产物生物活性的结果表明，突变菌株诱发小鼠肠液分泌的能力较野生菌株明显减弱，而小鼠口服突变菌株的半致死剂量较野生株明显增高，提示stn基因是鼠伤寒沙门菌致病机制中一个较为重要的毒力因子。
随着抗菌药物的广泛应用,在抗菌药物的选择压力下,细菌不断发生耐药性变异,以求生存[1].虽然人们对细菌的耐药机制进行了广泛和深入的研究,并从抗菌药物治疗及药物开发方面做了大量工作,但细菌耐药仍变得越来越严重,部分原因是由于目前基于MIC的治疗浓度,仅阻止了大部分敏感细菌的生长,而使耐药突变菌株得到选择性富集扩增[2,3].为了减少细菌耐药,人们曾试图用限制抗菌药物使用及抗菌药物轮换使用等手段,但效果并不理想.为了解决这一难题,DrlicaK等提出了防突变浓度(mutant prevention concen-tration,MPC)和突变选择窗(mutant selection win-dow,MSW)概念,现将有关文献综述如下:
近20余年来,由于耐药结核杆菌尤其是耐多药结核杆菌(MDR-TB)的肆意横行,各国的结核病疫情均呈回升趋势,全球发病率和死亡率不断升高[1].我国的耐药情况尤为严重.据统计目前初始耐药率为18.6%,获得性耐药率为46.5%,全国现有耐药的涂阳肺结核病人约42万;在全球对53个国家的耐药调查中,河南省的原发MDR-TB耐药率位居第2位.因此在WHO最近公布的全球38个国家和地区的结核病耐药监测资料中,中国被列为"特别引起警示的国家和地区"之一[2].近年来,各国学者采用分子生物学技术对结核杆菌耐药机制进行深入研究,定位了结核分枝杆菌包括异烟肼在内的耐药基因的位置和基因突变位点,从而促进了第一代快速鉴定耐药突变菌株方法的建立和新型抗结核药物的开发.
近年来,由于新型抗菌药物不断出现和抗菌药的广泛应用,逐渐导致耐药菌株的不断出现,尤其滥用抗生素,造成抗药突变菌株的大量出现,临床上某些重症感染的病人,因没有选择好适当的抗菌素,最后造成病情感染加重,甚至死亡,更为重要的是我国药敏试验中存在的主要问题之一:"药敏试验结果慢,检验与临床缺乏沟通,致使药敏试验结果不能满足临床治疗要求[1].对此问题,笔者在实际工作中深有体会,所以于1995-1997年随机分批运用K-B法做了300例混合药敏试验,其具体方法如下:
近年来各种抗生素的大量应用,尤其广谱抗生素的滥用,造成耐药突变菌株的大量出现,经验用药失败率高,大剂量用药易造成药物中毒.检测病原微生物对抗生素的敏感性是临床微生物实验室最重要的任务之一;其目的是指导临床上治疗某个病人选择最佳的抗生素,避免由于用药不当,产生耐药菌株.由于新的病原体和新的耐药机制的出现,对实验室的药敏提出了更高的要求:必须提供准确的数椐,作为临床治疗的参考.以下就药敏方法、实验操作、结果报告加以讨论.
目的:用甲基磺酸乙酯(Ethylmethylsulfone,EMS)诱导D型沙眼衣原体突变,利用间接免疫荧光法筛选出突变菌株,为研究不同衣原体基因的功能提供实验依据.方法:将D型沙眼衣原体标准株接种McCoy细胞,加入EMS诱导突变,收集存活菌株,利用空斑实验进行衣原体的分离和纯化,并用不同衣原体蛋白单克隆抗体做间接免疫荧光实验筛选突变株.结果:用间接免疫荧光筛选经EMS作用的沙眼衣原体,筛选出三株包涵体形态偏小的菌株(56#、58#、95#),一株圆形包涵体的突变株(61#)和一株D413N表达阴性的突变菌株(83#).结论:用EMS作为诱导剂诱导D型沙眼衣原体突变,并成功筛选出三种突变株.为寻找衣原体功能基因与衣原体表型之间的联系奠定了实验基础.
目的 对产纽莫康定B0的丝状真菌(Glarea lozoyensis) ATCC 74030进行原生质体制备、再生及常压室温等离子体诱变育种进行研究,选育高产纽莫康定B0的菌株.方法 采用单因素实验法研究了原生质体形成和再生的最佳条件,并将原生质体通过常压室温等离子体诱变.结果 Glarea lozoyensis原生质体形成和再生的最佳条件为:菌体培养9d,0.6mol/L的葡萄糖溶液作为渗透压稳定剂,采用2％ Yatalase+3％溶壁酶+1％蜗牛酶组成的复合酶系,34℃条件下酶解3.5h.经过常压室温等离子体诱变,筛选出的原生质体诱变菌株G lozoyensis Q1,其产量达1.13g/L,相对出发菌株产量(0.81g/L)提高了39.5％,且连续传代5代遗传稳定.结论 常压室温等离子体诱变提高ATCC 74030发酵单位效果明显,实验结果表明突变株G.lozoyensisQ1具有潜在的生产应用价值.
目的 用实验室保藏的格尔德霉素产生菌Streptomyces melanosporofaciens101,通过抗性选育,获得高产突变株.并研究该菌株的工业化发酵工艺.方法 经硫酸二乙酯诱变和添加代谢终产物(格尔德霉素)抗性筛选,格尔德霉素抗性浓度从5g/L提高到10g/L,筛选高产突变菌株.再进行发酵罐上工艺优化,分别进行了单批发酵和分批补料发酵研究.结果 获得的高产突变株其生产能力比出发菌株提高了1000倍.在96、120、144和168h分别补加总体积3％的葡萄糖,该分批补料发酵工艺适合格尔德霉素工业化生产.结论 格尔德霉素高产突变株的筛选和发酵工艺的确定为该项目产业化奠定了基础.
