目的 构建粪肠球菌丝氨酸蛋白酶基因(sprE)突变株,通过动物实验来研究sprE基因的功能.方法 通过小鼠腹膜炎模型和兔心内膜炎模型来评价粪肠球菌sprE基因的突变株(sprE mutant)的毒力下降情况.结果 突变株在小鼠腹膜炎模型中的半数致死量(LD50)提高了7倍,小鼠的存活率明显高于野生株感染组,引起的兔心内膜炎的病理改变也较野生株轻微.结论 sprE基因在粪肠球菌致病中起着重要的作用,可能是粪肠球菌的毒力因子之一.
最近有报道在肺炎链球菌发现HtrA(high-temperature requirement A)蛋白,与细菌克服高温、氧化和渗透压力有关.肠球菌原来属于D组链球菌,其许多特性与链球菌相似.肠球菌能否产生HtrA蛋白酶以及确切的功能目前尚不清楚.我们利用BLAST将肺炎链球菌HtrA蛋白酶编码基因与粪肠球菌染色体基因组进行同源性比较,发现粪肠球菌有一个全长为851 bp的开放性读框与肺炎链球菌htrA基因有较高的同源性.进一步从基因文库查找此开放性读框,发现它是编码粪肠球菌假定的丝氨酸蛋白酶基因,被命名为sprE.为了研究sprE基因的确切功能,利用基因敲除构建粪肠球菌sprE基因突变菌株,在不改变该细菌其它遗传性状的基础上,研究sprE基因在粪肠球菌抗高温和氧化作用.
目的 建立针对嗜水气单胞菌的高灵敏、高特异的实时荧光三重TaqMan聚合酶链式反应(PCR)快速检测体系.方法 根据嗜水气单胞菌的16S rDNA、气溶素基因(aerA)和丝氨酸蛋白酶基因(ahp)的特异性序列设计引物及TaqMan探针,利用高通量实时荧光PCR检测平台探讨该检测体系的灵敏度;用29种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌评价该检测体系的特异性.结果 实时荧光三重TaqMan PCR快速检测体系对嗜水气单胞菌重组质粒的检测灵敏度为1×102拷贝/反应体系;对嗜水气单胞菌基因组的检测灵敏度为5×10-2 pg/反应体系;该体系的特异性引物探针在检测29种其他肠道致病菌及院内感染中常见的致病菌时未出现假阳性,整个反应在2 h内完成.结论 本研究建立的实时荧光三重TaqMan PCR检测体系可作为嗜水气单胞菌灵敏、特异、快速的检测方法,并同时评价嗜水气单胞菌的致病潜力.
目的 构建丝氨酸蛋白酶同源基因(serine protease gene,sprE)敲除粪肠球菌突变株,来研究sprE基因的功能.方法 用pTX4577质粒构建粪肠球菌sprE基因重组自杀质粒pCQ001,通过体内同源重组,筛选获得sprE基因的突变株,体外研究不同温度和氧化条件对突变株生长能力的影响.结果 经同源重组,利用卡那霉素抗性筛选,PCR、脉冲场电泳和southern blot进行鉴定获得基因突变株# sprE,突变株在40℃的生长能力以及在氧化条件下的存活率均明显降低.结论 sprE基因献除粪肠球菌突变株# sprE构建成功,为进一步研究其功能打下基础.
