为摸清流感在我省的流行特点,了解人群对流感的免疫状况,及时发现有意义的流感变异株,给国家流感中心提供准确、及时的流感信息,为制定流感的防制措施提供科学依据.2001年我省按中国-WHO流感监测合作项目计划进行流感监测,现将结果报告如下.
慢性HBV感染由于病毒持续复制、启动和诱发机体免疫清除是造成肝脏损害的主要原因.
乙型肝炎(乙肝)是全球性重大公共卫生问题之一.据估计,全世界现有乙肝病毒(HBV)携带者3.5亿,其中我国约占1.2亿.乙肝血源疫苗和基因工程疫苗阻断HBV感染的效果已得到广泛认同,但随着乙肝疫苗的普遍推广,对可逃逸HBV中和抗体的表面抗原基因(S基因)变异株感染逐步有所认识.美国、新加坡、日本、英国及世界其他地区大量研究报告显示:联合应用乙肝高效免疫球蛋白和乙肝疫苗母要阻断失败者,DNA直接测序法检测,表面抗原氨基酸置换率约为10%～40%[1～3].据调查,我国单纯乙肝疫苗免疫后携带者表面抗原氨基酸置换率为31%,比未免疫携带者高6倍[4].大量实验研究结果均显示:HBV表面抗原基因变异株同野毒株一样,有致病力和传播能力,虽现有乙肝疫苗对变异株感染的预防效果有待进一步观察,但现有免疫诊断试剂对变异株常出现漏检.乙肝疫苗明显具有免疫选择基因变异株的作用,长期推广乙肝疫苗后,HBV基因变异株有可能在免疫后人群中流行而成为新的公共卫生问题.
目的 分析2012-2013年冬季中国地区诺如病毒新流行株GⅡ.4/Sydney 2012的衣壳蛋白区核苷酸与氨基酸变异特点.方法 对已获得的22份2012-2013年冬季北京地区GⅡ.4/Sydney 2012株进行全衣壳蛋白区基因扩增.从GenBank检索中国其他地区的GⅡ.4/Sydney 2012株衣壳蛋白区核苷酸序列.对获得的GⅡ.4/Sydney 2012株的衣壳蛋白区核苷酸及氨基酸序列与往年GⅡ.4流行株进行系谱分析.结果 获得中国7个地区(北京、上海、江苏、湖州、荆州、香港和台湾)的GⅡ.4/Sydney 2012株资料共38份(至少包含完整VP1核苷酸序列).GⅡ.4/Sydney 2012株之间VP1核苷酸差异为0.1％～3.3％,氨基酸差异为0～3.1％.系谱分析发现GⅡ.4/Sydney2012株与Apeldoom 2008和New Orleans 2009起自共同的分支.中国和悉尼GⅡ.4/Sydney 2012代表株的A、D、E抗原表位氨基酸序列组合有两种:TSRN-GTT-SNT和TSRN-STT-SNT.结论 GⅡ.4/Sydney 2012株已在中国多个地区出现,各地区病毒株同源性较高.GⅡ.4/Sydney 2012株的抗原表位氨基酸组合发生明显改变.
在无脊髓灰质炎(脊灰)证实后期,高危聚集性急性弛缓性麻痹(AFP)病例一直是及时发现是否存在脊灰野病毒传播的有力证据.
目前治疗慢性乙型肝炎最重要和最有效的方法是通过抗乙型肝炎病毒(HBV)药物抑制病毒复制[1].核苷(酸)类似物具有高效、低毒、服用方便等特点,在临床上得以广泛应用[2].阿德福韦酯是一种新型核苷(酸)类抗病毒药物,临床研究表明阿德福韦酯对HBV野生株以及对拉米夫定及其他抗HBV药物出现耐受变异株的HBV均有很强的抗病毒活性.探讨HBV基因型和抗病毒疗效的相关性及其机制,对于指导临床选择有效抗病毒药物、预测抗病毒疗效具有重要的参考价值和理论意义.笔者观察了不同HBV基因型对阿德福韦酯抗HBV疗效的影响,现将结果报告如下.
急性出血性结膜炎(acute hemorrhagic conjunctivitis,AHC)俗称红眼病,为季节性传染病,多发生在夏秋季,其病原主要是微小核糖核酸病毒科中的人肠道病毒70型(enterovirus 70,EV70)和柯萨奇病毒A组24型变异株(coxsackievirus A24 variant,CVA24v),腺病毒也可以引起AHC的流行[1].2010年山东省青岛市和临沂市出现AHC流行,报告病例数居全省前2位,笔者对AHC患者眼结膜拭子标本进行了病毒分离鉴定,现报告如下.
为了明确传染性性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)分离株CK/CH/SD09/005的分子特征,以进一步丰富国内IBV的分子流行病学信息.本研究设计了25对引物对其全基因组进行了序列测定,并与参考株进行了同源性比较和S1基因遗传进化分析.结果显示CK/CH/SD09/005基因组为27 691bp(不包括5'端Cap和3 '端Poly A).全基因组同源性比对发现,CK/CH/SD09/005仅与GenBank中广西2009年分离株GX-NN09032各基因高度同源(97％～99％).除GX-NN09032外,CK/CH/SD09/005基因组5'端复制酶基因(Gene 1)和3'端非转录区(Untranslated region,UTR)与2个QX基因型参考株ck/CH/LDL/091022和SDIB821/2012同源性最高,分别为97％和98％,但是3'端结构蛋白和非结构蛋白基因(S-3a-3b-3c/E-M-5a-5b-N)与这两个毒株同源性较低,仅为72％～90％.其ORF3c/E、5a、5b和N分别与韩国分离株1011、国内分离株CK/CH/LXJ/02I、DK/CH/HN/ZZ2004和YX10同源性最高,分别为97％、96％、99％和96％,而其ORF3a、3b和M与参考株同源性均低于90％.S1基因遗传进化分析发现,CK/CH/SD09/005和国内外39个参考株形成7个进化分支(基因型),CK/CH/SD09/005和2007以来几个分离株属于基因Ⅳ型,与其它6个基因型参考株S1和S2基因同源性为66％～69％和72％～81％,S1基因不仅表现广泛性点突变,而且有多处碱基插入和缺失,S2仅表现点突变.本研究结果表明CK/CH/SD09/005是一个变异株,可能是QX基因型IBV流行株与其它毒株重组进化而来,此外还涉及基因突变、插入和缺失等多种变异机制.
鸡传染性法氏囊病(infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)引起的一种危害鸡的急性、高度接触性、免疫抑制性传染病.该病由Cosgrove于1962年作为一种新的疾病首次报道,最初病死率并不高(5%左右),但到了上世纪80年代末90年代初,陆续出现了变异株和超强毒株,病死率大大提高(80%左右).该病现已大面积流行于欧州、东南亚、非州、南美洲等[1].我国的流行情况也十分复杂,变异株和超强毒株均有报道.
为了解SEN病毒中国株的流行病学及基因序列,采集肝炎患者(甲～戊型)、非甲～非戊型肝炎患者、ALT升高的婴幼儿、尿毒症患者、静脉毒瘾者和健康体检人群的血清标本,用巢式PCR检测SEN病毒,结果他们的检出率依次为13.3%、20.5%、4.8%、5.8%、5.7%和0.PCR获得了两种不同长度阳性片段.选取5份阳性PCR产物进行纯化、连接及转化,获取重组克隆,命名为pGCEM-SENVL(1、2、3)、pGEM-SENVS(1、2),进行DNA序列分析.结果与SEN病毒(AX025667)序列同源性分别为87.7%、76.1%、88.2%、72.7%和78.8%.首次发现我国存在SEN病毒散发感染,并存在不同于SEN病毒(AX025667)的中国变异株,而且有同一患者存在两种变异株的复合感染.
乙型肝炎(简称乙肝)是我国重点防治的传染病之一,我国一般人群中表面抗原(HBsAg)阳性率在10%左右.随着抗病毒药物的临床应用,乙肝病毒(HBV)变异株也逐渐增多.为了加强对HBV潜伏期的预测、对乙肝病情动态的有效监测、对药物疗效的预测,作者通过酶联免疫吸附试验(ELISA)结合时间分辨荧光免疫测定(TR-FIA),能有效检测乙肝标志物(HBV M);特别对低浓度的HBV M的有效检测,在临床及流行病学中具有一定的价值[1].现初步报道如下.
肠致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli. EPEC)是引起婴幼儿腹泻的重要病原菌之一.粘附是EPEC感染宿主肠粘膜上皮细胞关键的第一步.因此准确测定EPEC对靶细胞的粘附能力,有助于判定其致病力.通过分析比较EPEC有菌毛株O119和无菌毛变异株H511对人喉癌上皮细胞HEp-2的粘附情况,以确定菌毛对EPEC粘附力的影响.
人乳头瘤病毒16型(Human papillomavirus type 16,HPV16)感染与宫颈癌的发生有密切关系.研究发现,HPV16早期蛋白E6是肿瘤相关抗原,可在HPV相关肿瘤中持续表达,为肿瘤治疗性疫苗的研制及免疫治疗提供了靶位.但也有文献报道,宫颈癌中HPV16E6基因可有一定的变异性,变异株可逃避机体体液和细胞免疫的攻击,给相应疫苗研制带来困难.为制定合理、有效的疫苗设计策略,本研究选择去除氨基端转化活性的HPV16E6羧基(C)端基因片段(nt254-559)作为构建疫苗的抗原基因,对我国妇女宫颈癌组织中E6C基因片段的序列进行分析,并在此基础上进行E6C的分子克隆,以期为宫颈癌HPV16E6DNA疫苗的研制提供资料.
第1例转基因烟草表达链球菌变异株SpaA(surfaceprotein antigenA)蛋白疫苗的成功研制~([1]),开启了利用植物表达动物病原抗原蛋白的新纪元.1992年,Mason等~([2])提出了"转基因植物疫苗"的概念,标志着植物口服疫苗成为新药研发新途径的全面展开.
随着聚合酶链反应法(PCR)技术广泛用于扩增血清和肝脏组织中的乙型肝炎病毒(HBV)DNA，现已发现一些乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阴性的HBV变异株[1]，人感染这些HBV变异株后，无血清HBV标记，从而给诊断、治疗和预防带来困难，目前对这些变异株在HBV携带者中所占比例及其致病性尚未充分了解。因此，研究其分子生物学特性具有重要意义。本文报道一例无血清免疫学标志的原发性肝癌患者HBv变异株的分子生物学特性。
HLAⅠ分子组成性表达于各种有核细胞表面,细胞因子可通过旁分泌或自分泌效应诱导其表达增强.Zhou等[1]实验表明HBV能增强HepG2细胞的HLAⅠ表面表达,排除细胞内IFN-β的产生和介导作用.为进一步研究其它内源性细胞因子的介导作用,我们构建HBV基因组野生株(WT)及核壳蛋白变异株L97稳定表达载体,探讨TNF-α对HBV转染细胞HLAⅠ表达的调节作用.
格林-巴利综合征(Guillain-Barré syndrome, GBS)是一种常见的周围神经病.其发生机制尚未阐明,较多资料显示GBS病人血清中存在多种神经节苷脂抗体,并发现轴索型GBS与空肠弯曲菌感染及抗神经节苷脂三者间存在密切关系[1],故空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, CJ)感染介导的自身体液免疫反应在轴索型GBS发病中的作用已引起广泛关注.
目的 了解贵阳地区GⅡ.4型诺如病毒变异株的组成及其点突变.方法 监测2010年6-11月于贵阳地区哨点医院就诊的急性胃肠炎病例,收集粪便标本,采用荧光定量逆转录-聚合酶链反应(real-time RT-PCR)初步鉴定,随机选取部分GⅡ型诺如病毒阳性标本,采用一步法RT-PCR对其VP1基因区克隆及测序,基因序列与国内外流行的GⅡ.4型诺如病毒进行系统进化及氨基酸位点的突变分析.结果 检测标本426份,有267份(62.68％)GⅡ型诺如病毒阳性,测序获得了9份GⅡ.4型诺如病毒VP1基因组序列,贵州省2010年流行的GⅡ.4型诺如病毒包括2个变异株(GⅡ.42008a和GⅡ.4 2008b新型变异株),亚型组闻的VP1基因的同源性为95.90％ ～ 96.72％,亚型组内同源性为99.45％ ～ 100％,有2个氨基酸位点易发生突变.结论 贵阳地区2010年夏秋季急性胃肠炎以诺如病毒GⅡ型为主,并且变异株具有多样性.
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA),可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类分子.HLAⅠ在正常肝细胞表达很弱或全无表达,HBV感染肝细胞时,表达量与炎症程度呈正相关.我们将所构建的野生型和变异型乙肝表面抗原中蛋白基因重组质粒转染HepG2细胞,以研究HBV/S基因变异株对宿主细胞HLA表达的影响,从而对变异株造成的肝脏炎症程度作出初步的推论.
世界范围内,宫颈癌是妇女第二位高发肿瘤.高危型人乳头瘤病毒(human papilloma-virus,HPV)持续感染是引发宫颈癌的主要原因,在所有高危型HPV中,HPV16流行最广泛.HPV主要衣壳蛋白(major capsid protein,L1)可以自组装成病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs),其形态及抗原性与天然病毒类似,可以刺激机体产生高效价保护性中和抗体.中和表位是HPV VLPs疫苗的结构基础,疫苗的效力主要取决于中和表位的完整性.目前基于中和单抗的HPV16表位研究取得了极大进展.随着免疫压力的增加,HPV16的型内变异株越来越多.1204条HPV16 L1氨基酸序列构建的进化树可以分为4个进化分支.同时,将其与114K参考序列相比,共挑选出8个"高频突变位点",6个"特有突变位点"和20个"表位相关位点".HPV诱导的中和抗体绝大多数都是型特异性的,但同一型别内的HPV所诱导的中和抗体对型别内的所有L1变异株是否都能保护尚无定论.剖析HPV16型的抗原表位及型内变异情况对设计高效价、高覆盖率的预防性疫苗至关重要.
乙型肝炎是一种严重威胁人体健康的疾病,尤其是在我国,人群中HBV感染率一直居高不下,约有1.3亿人为HBVDNA携带者.由于免疫和药物的双重压力,HBV感染人群存在一定比例的变异株的流行.因此,如何控制变异株的流行,制定新的免疫和检测策略,则需要了解其流行情况.此外,针对变异株感染的抗病毒治疗,也是临床有效治疗HBV感染者的重要一环.这些都需要对HBV的基因组序列进行分析.
同一种病毒不同分离株(变异株)之间核苷酸序列及抗原性之间的差异造成了各分离株间血清学反应性、致病性、毒力、对治疗的应答、流行区域及分布等的不同.因此，进一步研究病毒分型对流行病学调查、病毒毒力强弱的研究、不同亚型病毒特异疫苗的研制、病毒感染的自然历程及其持续感染在发病过程中的作用、病毒的演变过程、病毒与宿主的相互作用及临床治疗效果等有着十分重要的意义.
预防和控制HBV感染是全球性的、迫切需要解决的难题.由于多样性HBV变异株的存在大大增加了解决这一难题的复杂性.随着分子生物学技术的不断发展,人们对HBV变异多样性的认识逐步深入,尤其是S基因变异的研究倍受重视.本文就S基因变异及其医学意义的研究新进展作一简要综述.
近年来,国内外专家对治疗慢性乙型肝炎(慢乙肝,CHB)已形成了共识[1-5],认为抗病毒是治疗CHB的重要关键环节.临床研究发现:HBV在人体存在的形式是野生株与各种变异株混合存在,HBV本身致病性有限,肝脏的病理改变主要是机体的免疫系统在清除病毒过程中引起的免疫损伤.
1临床资料1.1一般资料入选38例患者均为2002年1月-2004年2月我院住院的慢性乙型肝炎患者.诊断符合2000年9月中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝病学会联合修订的<病毒性肝炎防治方案>诊断标准[1].其中男23例,女15例,平均年龄34.3岁.入院前均经拉米夫定治疗6～24个月.HBVDNA、HBeAg阴转后又复阳,ALT升高正常上限2～12倍,胆红素升高30～145μmol/L,基因测序发生YMDD变异(以YVDD为主).所有病例随机分为2组.
目的:建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦(ADV)耐药变异-rtN236T变异的快速检测方法.方法:根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物,使野生株(rt236N)PCR产物中含有DraI酶切位点(5'TTTAAA3'),而变异株(rt236T)无此限制性酶切位点.同时PCR扩增2份已行HBVRT区基因测序证实未出现rtN236T变异的慢性乙型肝炎患者血清及自行构建的对照质粒,扩增产物经DraI酶切,30 g/L琼脂糖凝胶电泳后,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析.结果:所建立的ntPCR-RFLP方法灵敏度高,可以检测到106copies/L的HBV DNA;特异性强,其RFLP分析结果与DNA测序结果一致.结论:ntPCR-RFLP方法灵敏、特异、简便、实用,适用于ADV耐药变异的临床监测工作.
目的:探讨基因芯片技术在乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)及HBV YMDD变异株检测中的应用.方法:采用HBV、HCV联合基因芯片检测40份血清标本,并与HBV,HCV基因定量检测方法比较;采用HBVYMDD变异株芯片检测20份血清标本,并与错配PCR及DNA序列测定方法比较.结果:HBV,HCV联合基因芯片与HBV DNA定量检测的符合率为85%(34/40),HBV检出率为83%(19/23),假阳性率为12%(2/17);与HCV RNA定量检测的符合率为85%(34/40),HCV检出率为58%(7/12),假阳性率为4%(1/28).HBV YMDD变异株芯片与本室设计的错配PCR符合率为70%(14/20),5份芯片检测的标本与DNA序列测定结果一致,该芯片尚可检测出不同病毒体或变异体的混合感染.结论:HBV,HCV联合基因芯片对HBV的检测有较高的敏感性,但存在一定程度的非特异性;对HCV的检测敏感性偏低,但特异性较高.HBV YMDD变异株芯片敏感性和特异性均较高,同时能检测出病毒变异体的共生现象.
目的:制备一款肝炎病毒检测芯片,能同时实现对乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、HBV YMDD变异株及HCV基因型的检测,并与其他检测方法进行比较,以探讨基因芯片技术临床应用的可行性.方法:根据HBV、HCV的序列设计出探针,采用点样法制备芯片.收集HBV DNA阳性和HCV RNA阳性血清各20份,YMDD变异株阳性血清20份,HBV DNA阴性和HCVRNA阴性血清各10份,用基因诊断芯片检测,并与荧光定量法、错配PCR及测序法比较.结果:HBV DNA阳性标本和HCV RNA阳性标本用芯片检测均为阳性;芯片法检测HBV YMDD变异株和错配PCR法的符合率为75%,和测序法的符合率为95%;芯片法检测HCV基因型和测序法的符合率为75%.结论:基因诊断芯片的敏感性和特异性较高,且能检测出不同病毒株的共生状态,但在检测HCV基因型方面存在一定的假阴性和假阳性.
目的:研究HBV adr亚型野生株和核壳蛋白变异株在HepG2细胞表面的HLA-Ⅰ/抗原肽复合物的表达.方法:通过定点突变技术将1.2拷贝HBV野生型质粒p3.8Ⅱ构建成核壳蛋白变异株V60和L97.经序列测定和生物学活性检测后,野生株和变异株重组质粒分别亚克隆入EB病毒表达载体EBO-plpp以稳定表达.重组载体EBO-野生株、EBO-V60和EBO-L97分别作内切酶双酶切和序列测定鉴定,再用脂质体介导转染HepG2细胞,ELISA(Abbott)试剂盒定量检测各株培养上清HBV抗原,转染细胞用FITC标记的鼠抗HLA-ABC单抗染色,流式细胞术分析细胞表面HLA-I表达.结果:3株重组载体经内切酶消化,电泳后显示2条区带,分别与1.2拷贝HBV基因组和EBO载体大小相同.测序结果证实EBO-V60和EBO-L97分别在nt2078 C→G和nt2189 A→C,保持原定点突变.EBO-野生株的培养上清HBeAg定量S/CO值明显高于变异株V60和L97,3株HBsAg定量S/N值接近,HBsAg表达相近表明实验的转染效率相当.EBO空载体转染的HepG2细胞HLA-I轻微表达,3株重组载体转染细胞HLA-I的荧光强度不同,野生株增强为18.2,L97明显升高至34.5,而V60降低至3.4.结论:HBV能增强HepG2细胞表面HLA-I/抗原肽复合物的表达,核壳蛋白热点变异V60和L97可使宿主细胞HLA-Ⅰ表达发生变化.
