目的:探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性.方法:查阅国际上主要的乙型肝炎病毒(HBV)基因分型诊断标准和现行技术,通过将基因芯片技术与目前用于HBV基因分型的技术方法进行对比,探讨利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断方法的可能性.结果:HBV的基因分型,既可通过全基因序列比对,也可通过片段基因序列比对,片段基因序列比对是实际工作中HBV基因分型的主要方法,现有报道的技术主要为型特异引物(SSP)PCR扩增法和PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法.基因芯片技术具有高敏感、高通量和能够平行检测DNA类型等特点,技术类型属于PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法.尚未见有应用基因芯片技术进行HBV基因分型检测的报道.结论:借鉴现有的PCR扩增型特异探针(SSO)杂交法,如微板核酸杂交-ELISA显色技术,理论上利用基因芯片技术建立乙型肝炎病毒基因分型诊断的方法是完全可能的,并且具有高效、快速和廉价等特点.
自Reyes1990年首次克隆出缅甸株HEV基因序列以来,国内外不同基因型的HEV毒株陆续被发现.科学家们对已分离的HEV毒株进行了全基因及部分基因的克隆及测序,借助于系统软件的分析对HEV进行了基因分型,发现在世界范围内HEV基因型地域分布特征发生了很多变化.本文回顾了HEV基因型地域分布演变的过程,概括了HEV基因型新的地域分布特征.
大气颗粒物不断地危害着人类健康,它不仅与呼吸系统疾病、心血管疾病具有关联性,而且还可以诱导氧化应激、免疫缺陷和慢性炎症等与致癌作用至关重要的生物变化,而这些生物变化可以通过改变甲基化机制影响基因表达.在应对环境压力时,特定位点的DNA甲基化可以发生快速改变.Miousse等[1]研究指出当PM1.以10 ～ 200 μg/ml的浓度染毒细胞时,DNA的甲基化发生了改变.在人类癌症的发展中,DNA甲基化已成为一种主要的表观遗传机制.DNA甲基化的改变可以激活致癌基因并使抑癌基因沉默,从而导致基因组不稳定及癌症的发生.因此研究大气颗粒物与甲基化之间的关系对确定高危人群及疾病的预防与筛选有十分重要的意义.
目的 获得深圳口岸首例入境人员HIV-1亚型毒株全长基因组序列并分析其特征.方法 以深圳出入境检验检疫局HIV确证实验室确证的1例HIV感染者为研究对象,提取病毒RNA,利用逆转录巢式RT-PCR技术,分两段扩增病毒近似全长基因序列,对PCR产物进行核苷酸序列测定,应用生物信息学软件对全基因序列进行系统进化分析.结果 获得了8 831 bp长度的近全长基因组序列,系统进化树分析结果显示该毒株与HIV-1 CRF01_AE亚型参考株成簇,Bootstrap值为100％,通过与世界上不同国家和地区流行的HIV-1 CRF01_AE亚型毒株比较,该毒株与泰国流行毒株的关系最近.结论 该毒株是由境外传入的,应对入境人员HIV感染毒株的来源和变异进行密切监测.
2008年7-9月河南省多个地区出现以儿童为主的中枢神经系统感染性疾病暴发,证实为肠道病毒Echo6型感染[1].本研究筛选2株脑脊液分离株进行全基因组序列测定.1.材料与方法:(1)标本及毒株:2008年河南省开封市、洛阳市各1例病毒性脑炎患儿的脑脊液标本,经人横纹肌肉瘤细胞分离得到病毒,并经肠道病毒VP1区通用引物扩增,测序后鉴定为Echo6病毒,分别命名为Echo6/Henan/116/2008和Echo6/Henan/127/2008.
麻风病是由细胞内寄生的麻风分支杆菌引起的慢性传染病.现认为,除了环境因素之外,麻风病的发病和临床结局主要取决于机体免疫反应能力及个体的遗传易感性.国内外已经对病菌本身和宿主免疫反应等方面开展了较多的研究,但对宿主遗传易感性方面的研究刚开始.早已观察到下列现象与宿主的遗传易感性有密切的关系.如:大多数感染麻风菌的人并非患病;麻风患者亲属的发病率高;同一地区,不同种族人群的患病率不等;家庭分离被证实, 即子代患病并非是随机的;在患病子代中,麻风两级(LL、TT)分布也并非是随机的;患者不可能因环境因素从一极转变为另一极,如从TT-LL或LL-TT等.在印度对患有麻风病的35对孪生子调查,发现在23对同卵双生子中,多数患者患同型别的麻风(17/19);而在12对异卵双生子中,患麻风病少,仅两对,而且型别各异[1].这提示麻风病具有遗传易感性.换言之,这种差异可能在较大程度上,由宿主遗传因素决定的,但相关的机理至今不完全清楚.近年来,麻风病免疫遗传学已从组织相容性抗原( HLA)与疾病相关性研究,发展至多学科的、采用全基因扫瞄及基因多态性分析[2-4].
丙型肝炎(丙肝)病毒(HCV)全基因或片段基因克隆的序列分析,据国内外报道证实至少存在12种基因型,不同国家地区核苷酸有很大差异.目前日本和美国已分离出4种基因型,美国以Ⅰ型为主,日本以Ⅱ型为主,中国是Ⅱ、Ⅲ型,其次是Ⅱ/Ⅲ混合型.不同基因型的HCV致病性及对干扰素治疗反应不同.我们对克拉玛依地区慢性丙肝患者血清HCV RNA进行基因分型的检测,了解该地区HCV基因型分布情况,指导治疗及判断预后.
本研究以一株2006年广东省分离的H9N2亚型禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/HL/2006(H9N2)(简称Ck/GD/HL/06)为研究对象,用RT-PCR法扩增病毒基因组各片段(包括5'端和3'端的非编码区序列),将扩增片段进行克隆、测序并与参考毒株的相应序列进行比较分析,绘制各基因片段的系统发生树.分析结果表明,Ck/GD/HL/06株的HA基因同1997年中国香港鸭源毒株Dk/HK/Y280/97(H9N2)在同一进化分支,从HA的糖基化位点、受体结合位点等综合分析,该毒株HA基因未发生明显的变异,符合我国大陆H9亚型禽流感病毒的特点.HA的226位氨基酸残基为亮氨酸(Leu),具有同哺乳动物SAα,2-6受体结合的特性.Ck/GD/HL/06的PB1、PA和NP基因.同2004年越南分离的人源高致病性H5N1亚型流感病毒A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)株(简写A/VN/1203/04)的核苷酸序列一致性分别是93.8%、95%和96.8%,在先前的研究中未见有类似特性毒株的报道,而这种特性H9N2亚型AIV的出现,是否会增加在重组过程中产生新的高致病性H5N1亚型AIV的可能性,是值得我们关注的一个问题,也提醒在我国华南地区应更加重视防控H9N2亚型AIV,做好长期对H9N2亚型AIV监控及分子流行病学调查的工作.
轮状病毒是引起儿童重症腹泻的主要病原.目前,绝大多数研究认为A组轮状病毒的VP6和NSP4基因在进化上紧密联系[1].我们曾报道过一株在世界上极为罕见的人A组轮状病毒GSP[6]毒株[2](LL3354),通过对该毒株的VP6和NSP4全基因的分析,发现LL3354的VP6和NSP4编码基因是通过独立进化而来.
肺炎衣原体是1989年确立的衣原体属新种，相对分子质量（Mr）为53×103的蛋白是高度保守的肺炎衣原体主要的种特异性抗原〔1〕，位于病原体表面，其全基因含1*!482个碱基对，推测编码493个氨基酸。Mr 53×103蛋白与肺炎衣原体慢性感染有关，可能用作感染慢性化的标志〔2〕；抗Mr 53×103单抗能中和肺炎衣原体的感染〔3〕，表明Mr 53×103蛋白还是一个理想的预防肺炎衣原体感染的分子疫苗候选者。本实验克隆和表达了肺炎衣原体Mr 53×103蛋白的全长基因，为进一步研究该蛋白是否参与肺炎衣原体毒力因子的构成，以及其在肺炎衣原体感染检测上的意义和能否作为预防肺炎衣原体感染的分子疫苗等打下基础。
乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的慢性肝脏疾病仍然是我国主要的传染病.1979年首次完成HBV DNA的克隆化之后,随着对更多的HBV DNA全基因或基因片段的克隆和序列分析,发现不同患者感染的HBV DNA序列存在差别,而且不同基因序列的HBV感染机体后产生的抗体应答的性质也存在显著的差别,因此,根据HBV感染之后抗体应答性质的差别,将HBV分成不同的血清型(serotype);根据HBV DNA基因序列的不同,将HBV分成不同的基因型(genotype).临床研究结果表明,不同血清型和基因型的HBV感染的流行病学特点、临床表现、预后、抗病毒治疗的应答等存在显著的不同.这仅仅是认识到不同患者感染的HBV存在异质性(heterogeneity),但是对同一患者血清中存在的不同拷贝的HBV的基因序列究竟是否存在差别及其意义如何,一直没有引起人们的广泛重视.实际上,每一个患者血清中都存在大量拷贝的HBV,每一拷贝的HBV DNA序列不尽相同,表现出准种(quasispecies)的特点[1,2].
国内外研究表明HBV基因型与病毒的感染途径、基因突变、疾病进程、抗病毒药物疗效有一定的关系[1-3]引,了解HBV基因型分布,追溯感染源对判断预后、监测抗病毒用药疗效、选择个体化治疗方案等具有重要应用价值.目前根据全基因序列同源性>92%或S区基因序列同源性≥96%,HBV分为A～H 8个基因型,在亚洲主要是A～F[4],国内主要基因型为B和C型.
A组链球菌(GAS)是临床上最为常见的病原微生物,其引起的疾病包括链球菌性咽喉炎,链球菌性伤口感染,中毒性休克,"食肉"病,猩红热,风湿性关节炎和肾脏病等.美国过敏和传染病研究所(NIAID)科学家为弄清为什么有些GAS株能引起严重感染而另外一些GAS株仅引起轻度感染,对GAS基因组进行了研究.通过比较自不同GAS感染者体内GAS分离株的全基因蓝图,研究者试图找出疾病相关性基因序列.
丙型肝炎病毒(hepatitis CviruS,HCV)为单股正链RNA病毒.国内外已对数十个HCV全基因或片段基因进行了序列分析,并对HCV的基因型分型.近年研究表明,HCV的基因型及其变异与肝细胞肝癌(HCC)有者一定的关系.其中,HCV1b基因型与HCC的发生显著相关;HCV核心区的变异与HCC的发生可能相关;HCV NS3与HCC的发生相关;HCV NS5的序列相对稳定为诱发HCC所必须的;而HCV E2/NS1与HCC的发生尚无定论.丙型肝炎及由其发展而来的肝细胞癌至今没有令人满意的治疗方法.研究HCV基因型及其变异与HCC发生的关系对阐明HCC发生的机理和HCC的防治有着重要的意义,为HCC的治疗开辟了新的途径,成为近年来国内外研究的热点,通过对他的深入研究可能为HCC的基因治疗找到有效措施.
目的:探讨前S2抗原基因对乙型肝炎DNA疫苗免疫应答的影响.方法:采用常规PCR法从adr亚型全基因DNA序列中分别扩增HBV S和前S2+S基因片段,重组到VR1012载体中,转染COS-7细胞并免疫BALB/C小鼠.采用蛋白印迹、ELISA,ELISPOT等方法检测其在COS-7细胞内的表达及小鼠的体液及细胞免疫.结果:转染的COS-7细胞表达相应的目的蛋白,且前S2+S转染的细胞表达明显高于S转染的细胞的表达;免疫接种小鼠后2 wk产生HBSAb及HBsAg特异性CTL,前S2+S抗原免疫产生的HBsAb及HBsAg特异性CTL均强于S抗原免疫.结论:前S2抗原基因可增强乙型肝炎DNA疫苗刺激的免疫应答.
心力衰竭（heart failure，心衰）是指由于各种原因引起的心肌结构和功能的变化并导致心室泵血和（或）充盈功能低下的临床综合征。目前，随着高血压、冠心病治疗水平的提高以及人口的老龄化，心衰在我国的发病率和患病率呈逐年增加趋势，已经给社会和家庭带来了沉重的医疗负担[1]。
乙型肝炎病毒核心启动子(CP)部分缺失变异已证实在几种HBV感染的临床现象中存在[1-3].我们在一组14例血清抗-HBe阳性的无症状携带者中,发现有9例在nt1748(或nt1747)至nt1767间20(或21)个核苷酸的缺失,此9例中有5例合并有nt1896G→A点变异[4].本研究在此基础上,拟构建这种CP 20/21 bp缺失及合并存在A1896点变异的HBV全基因重组真核表达载体,并转染HepG2细胞,以研究此类变异株对病毒抗原表达的影响.
血液中DNA的提取是遗传性疾病、胎儿产前无创伤诊断、肿瘤和传染性疾病等临床早期确诊的基础技术和重要手段.外周血因取材方便,是临床上最常见的DNA基因组提取样本[1,2].目前,对大量临床血液样本DNA的提取方法多局限于酚-氯仿有机抽提法、盐析法、滤膜离心柱法等,但此类方法只能用于人工提取,不适合高通量样本的DNA提取,且大多存在耗时长、费用高而且操作繁琐等问题.为建立适合临床高通量血液DNA提取的方法,本研究采用Tecan 150-8型、Qiacube两种不同类型的全自动化DNA提取工作站,运用磁珠吸附法和硅珠膜吸附法,建立两种高通量自动化临床血液DNA提取法,并对其进行比较,旨在建立一种快速、高效、批量、适合不同临床需求的全血基因组提取方法.
据《PloS Genet》报道，Translational Genomics Research Institute (TGen)研究者们对6例处于进展期的弥散型肝内胆管癌（SIC）患者进行了研究，使用全基因测序技术，以试图寻找到药物靶点，实现胆管癌的个性化药物治疗。
目的 构建丙型肝炎病毒(HCV)全基因重组质粒,并建立其转染细胞系.方法 双酶切质粒JFH1,回收HCV DNA,分别与真核表达载体pIRESneo和逆转录病毒载体pLNCX连接,构建重组质粒pIRESneo-HCV和pLNCX-HCV.将重组质粒pIRESneo-HCV转染BHK细胞,pLNCX-HCV转染pA317细胞.通过PCR、间接ELISA和免疫荧光试验鉴定转染细胞.结果 重组质粒PCR和酶切鉴定证明构建正确.转染细胞上清经PCR检测均可见目的 基因条带;ELISA结果表明,转染细胞冻融上清均可与抗HCV小鼠血清发生强的结合反应;转染细胞均可与抗HCV小鼠血清反应,产生荧光,但荧光不多且斑点不亮.结论 已成功构建HCV全基因重组质粒,并建立了可表达HCV蛋白的转染细胞系,为转基因动物模型的建立奠定了基础.
乙型肝炎病毒(HBV)在逆转录过程中由于不对称复制和缺乏校对酶的作用,突变率较高.根据HBV DNA全基因核苷酸序列的异质性≥8%为一种基因型,目前HBV可分为A～H 8个基因型[1,2].
IFN-λ是近年来发现的Ⅲ型IFN[1-2],与Ⅰ型IFN -样,均可通过激活Janus激酶信号转导及转录激活子(Janus kinase signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)通路来完成信号传递,因此IFN-λ显示了与IFN-α相似的抗病毒、抑制肿瘤细胞生长以及免疫调节等生物学活性,但由于其特异性受体分布的不同而表现出骨髓抑制作用弱、不良反应少、生物学作用长而稳定等优势.全基因关联分析发现,IFN-λ相关的单个核苷酸的多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)与原发清除HCV 以及IFN抗HCV疗效之间密切相关,临床试验结果亦显示了IFN-λ的安全性和有效性,因此,IFN-λ有望在不久的将来成为一个新的抗HCV基因工程药物.
根据HBV全基因核苷酸序列异源性≥8%或者S基因区核苷酸序列异源性≥4%,将不同病毒株分为不同的基因型,迄今为止,HBV可以分为8个基因型,即A、B、C、D、E、F、G和H型[1,2].研究表明,HBV基因型的分布具有明显的地域性,A型主要分布于西欧、北欧、北美洲及非洲地区;B型和C型主要分布于亚洲,澳大利亚的HBV主要基因型也是C型;D型分布最为广泛,主要分布于中东、北非和南欧,亦是地中海地区HBV的主要基因型;E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地带;F型主要分布于美国;G型在法国和美国被发现;H型在尼加拉瓜、墨西哥及美国加里弗尼亚地区被发现.
俄罗斯遗传学专家雷奇科夫通过几十年的研究后发现，血缘关系越远的婚姻所生的孩子越聪明，近亲结婚后患无穷，会使后代的智力或身体有严重的缺陷。俄罗斯著名诗人普希金是非洲人的后裔，莱蒙托夫有苏格兰的血统，俄罗斯著名诗人茹科夫斯基的母亲是土耳其人。而普希金由于近亲结婚，其子女没有一个成器的。 雷奇科夫指出，决定一个人眼睛颜色或身高及是否易感染某些疾病的所有基因都是成对的，它们分别来自自己的父亲和母亲，而真正起作用的只有一种基因。黑人父亲和白人母亲生的孩子或像父亲一样皮肤黝黑，或像母亲一样皮肤白皙，但绝不会是黑白相间。带有疾病因素的不健全基因往往不起作用。但如果父母的血缘关系近，双方都带有不健全的基因，孩子就不可避免会有缺陷或疾病。
TTV(Tvansfusion Transmitted Virus)是继甲、乙、丙、丁、戊及庚型肝炎病毒之后最近才被发现的新型肝炎相关病毒,1997日本学者Nishizawa等首先报道[1],Okamoto对TTV全基因进行了测定,许多国家相继进行了TTV的研究,为了探讨TTV在鲁北地区的感染状况,我们以套式聚合酶链反应(NestedPCR)对一组肝病患者和供血者血清标本进行了检测,证实TTV在该地区存在.报告如下.
自从1988年Okamoto等首次根据组间全基因序列差异≥8%对HBV进行基因分型以来,对HBV基因分型方法学上的改进、和其所存在的地域性、民族特异性、以及它的临床意义都展开了大量研究,这对从分子水平阐明不同基因型的流行势态,和对其病因学的研究,加强对HBV的防治有重要意义.基因型反映了HBV自然感染史发生的变异特点,是病毒变异进化的结果,对其分型标准的依据是全基因序列同源性≥92%或S基因序列同源性≥96%.大量HBV序列分析工作提示S基因序列稳定,不同基因型各开放读框中S基因异质性最大,而同一基因型中的各毒株S基因异质性最小,因而S基因适于基因型分型.目前HBV基因型分型方法学有4种,可将其分为A、B、C、D、E、F、G等7种.其分型方法包括1、全基因或S基因测序法,该方法是鉴定基因型的金标准,但工作量大.2、Lindh等创立的S基因的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法,可鉴定89%的基因型,国内文献[1]报道对PCR-RFLP方法进行了改进,可鉴定95%以上的标本,但PCR-PFLP分型法所需时间较长、步骤较多,且遇到混合感染或酶切不完全,就会出现复杂带型,因此目前建立的PCR-PFLP分型方法都不能鉴定100%的标本.3、多引物PCR分型方法[2],它是在对114例HBV全序列进行充分比较分析的基础上,找出每种基因型相对于其他各种基因型的独特序列,并根据这些独特序列设计出6对分别针对性A-F型的诊断引物,利用其仅需一次PCR可得出分型结果,理论上能鉴定100%的标本.4、单克隆抗体酶联免疫吸附法,该方法虽然简便,但要建立一套单克隆抗体则较为困难,且难以从基因水平上对HBV进行分型.HBV的基因型分布在不同地理区域有不同的特点.
1997年 Nishizawa等 [1]从日本一名输血后非甲非戊型肝炎病人克隆到 1个 500 bp的片段 (N22),证实其与输血后肝炎高度相关,并把该基因片段可能代表的病毒以病人名字命名为 TT病毒 (TT virus, TTV).同年,日本科学家完成 TTV全基因的测定.我国 1998年 6月由中国军事医学科学院首次分离出中国株 TTV[2].目前,许多国家都已开展了对 TTV的研究并取得较大进展,但仍存在一些问题.现将有关情况综述如下.
1. 材料与方法：乳哺动物细胞表达载体pBK-CMV，长约4.5kb，带有T7公用序列。pCP10是pBR322 EcoRI位点中插入双拷贝头尾相接的HBV ayw亚型全基因HBV DNA重组质粒。PCR引物XI1：1428-1448 nt 5′CGT CCC GTC GGC GCT GAA TCC 3′，XI2：1672-1653 nt 5′AGT CCA AGA GTC CTC TTA AG 3′。人肝癌细胞系SMMC-7721，由上海细胞所提供。将EcoRⅠ酶切后回收的全基因HBV片段，在T4 DNA连接酶作用下，与EcoRⅠ酶切后的pBK-CMV粘端连接。利用pBK-CMV具有T7公用序列，选用XI2、T7作为引物，PCR出现1.7kb阳性条带为反接，并命名为pBK-AHBV。用FUGENETM6转染试剂转染SMMC-7721细胞。在含10%FCS的RPMI 1640（pH7.4）培养基中培养至60h后，用总RNA抽提试剂（Trizol Reagent）提取转染的SMMC-7721细胞，依次获得总RNA、DNA。
目的 建立一种用于低拷贝乙型肝炎病毒(HBV)不同基因型全基因组扩增的巢式聚合酶链式反应(nested PCR)方法及应用评价.方法 通过设计和改良一组对HBV各基因型(A,B,C,D,E,F,G) DNA均具有较高扩增效率的通用巢式简并引物,采用两步法分六段(Ⅰa,Ⅰb,Ⅱa,Ⅱb,Ⅲ,Ⅳ)扩增低拷贝HBV基因组,比较不同反应条件对于PCR扩增产物的影响(退火温度,引物浓度),建立一种适合于低拷贝HBV全基因组扩增的方法;同时采用该方法对57份低浓度HB-sAg乙肝感染者(HBsAg＜10IU/ml)的全基因组进行扩增、测序、拼接并进行评价.结果 该方法的灵敏度可达25IU/ml,重复性好,对57份低浓度HBsAg乙肝感染者进行扩增,其中全基因扩增49例(86.0％),各片段(Ⅰa,Ⅰb,Ⅱa,Ⅱb,Ⅲ,Ⅳ)扩增分别为:53例(93.0％),52例(91.2％),54例(94.7％),54例(94.7％),55例(96.5％)和49例(86.0％),说明该方法适用于慢性低浓度HBsAg乙肝感染者HBV DNA全基因扩增.结论 该文为慢性低浓度HBsAg乙肝感染者的全基因系列分析提供了高灵敏度、高特异度的方法,可在低浓度HBsAg感染者流行病学调查中发挥重要作用,同时为巢氏PCR扩增反应体系的优化提供了参考.
