准种的概念是由Eigen[1]在研究RNA病毒分子复制机制时首先提出的,2005年中国《慢性乙型肝炎防治指南》将乙型肝炎病毒(HBV)感染者体内形成的以一个优势株为主的相关突变株病毒群称为HBV准种[2].HBV准种的动态变化与抗病毒治疗效果有着密切联系,为此研究HBV准种特点能为临床提供抗病毒治疗的选择有着指导意义,亦为研发新的抗病毒药物提出挑战.
乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的慢性肝脏疾病仍然是我国主要的传染病.1979年首次完成HBV DNA的克隆化之后,随着对更多的HBV DNA全基因或基因片段的克隆和序列分析,发现不同患者感染的HBV DNA序列存在差别,而且不同基因序列的HBV感染机体后产生的抗体应答的性质也存在显著的差别,因此,根据HBV感染之后抗体应答性质的差别,将HBV分成不同的血清型(serotype);根据HBV DNA基因序列的不同,将HBV分成不同的基因型(genotype).临床研究结果表明,不同血清型和基因型的HBV感染的流行病学特点、临床表现、预后、抗病毒治疗的应答等存在显著的不同.这仅仅是认识到不同患者感染的HBV存在异质性(heterogeneity),但是对同一患者血清中存在的不同拷贝的HBV的基因序列究竟是否存在差别及其意义如何,一直没有引起人们的广泛重视.实际上,每一个患者血清中都存在大量拷贝的HBV,每一拷贝的HBV DNA序列不尽相同,表现出准种(quasispecies)的特点[1,2].
全世界有乙型肝炎病毒(HBV)感染者3.5亿人.对于HBV多年的研究已经积累了丰富的资料,但是,我们对于HBV基因组特性的认识远远没有穷尽,事实上还有许多方面需要进行探索.通过对特定慢性HBV感染者血清中不同的HBV病毒基因克隆序列的比较提出了HBV准种特点,使我们对于HBV基因组结构与功能的复杂性有了更为深入的了解.野生型病毒之间、野生型病毒与突变型病毒之间、突变型病毒之间的反式调节机制是各种类型的缺陷型HBV存在的重要条件和机制,也是HBV感染引起肝细胞癌(HCC)的重要的分子生物学机制.外周血中存在羧基末端截短的表面抗原中蛋白(MHBst)的编码基因,使我们对于HBV基因编码的反式激活蛋白的类型有了新的认识.通过对克隆的HBVDNA全长基因序列的比较,以及与其他地域所流行的HBV DNA序列之间的比较,发现了新型的开放读码框架(ORF),如前-X(pre-X)蛋白的编码基因和前-前-S(per-pre-S)蛋白的编码基因.长距离精确聚合酶链反应(LA-PCR)技术克隆的HBV DNA全长序列,是我国流行的adr亚型的HBVDNA全基因序列,代表了真正存在的HBV的基因全长序列,在HBV基因结构与功能的研究中,以及在抗HBV治疗疗效应答的研究中具有重要的理论和实际应用价值.
目的:报告SEN病毒核苷酸的异质性和准种特点.方法:取深圳地区SEN病毒流行病学调查得到的SENV D型或H型阳性血清各3份进行巢式PCR扩增,阳性PCR产物克隆至T载体,每份随机挑选1-11份阳性克隆进行分别测序,并与GeneBank上的北京株、美国株、意大利株和日本株进行比较分析.结果:挑选的16株克隆中D型和H型分别为13株和3株,均属于SENV序列.来自SZ-54的11株SENVD型克隆中准种占81.8%(9/11).本地3例患者的11株SENVD型阳性克隆与GeneBank的4株异地株,共15株间的同源性为77.7-99.5%.同一宿主9个克隆间的碱基变异个数为8.5±5.2,与同一地区不同宿主的11个克隆间的28.9±3.2和不同地区不同宿主的15个克隆间的29.6±7.8比较,有显著性差异(P均＜0.001).3株SENV H型阳性克隆与GeneBank的4株异地株共7株间的同源生为74.6-95.0%.进化分析表明,来自同一宿主的分离株遗传关系最近,同地区不同宿主的分离株其次,与4株异地分离株的遗传距离较远.结论:SENV核酸的变异性高,个体间存在较大差异,且在同一个感染者体内也存在大量SENV准种.在检测SENV的方法选择、比较SENV的序列差异和分析SENV的临床意义时应充分考虑到SENV的这种特性.
目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠,是基因组序列高度集中利用的-个典型.早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF),本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较,阐明基因组结构的特点,并探索是否存在新型ORF的可能性.方法:考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度,我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术,根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物,自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列,克隆入pGEM Teasy质粒,挑选克隆进行全基因组DNA测序,与其他HBV基因组序列进行比较.结果:测序结果5株HBV全基因组核苷酸序列存在一新的ORF,定义为前-前-S区,并发现该区之前存在一TA富集区,提示存在新型启动子的可能性.新界定的前-前-S区ORF编码氨基酸序列为MQLIITSKLGⅡYILCGRLVFYIREKLHAVPHFVGHHILGNKSYS,与前-S1、前-S2和表面抗原主蛋白编码基因框架一致表达.结论:在HBV基因组中存在有一新的ORF,命名为前-前-S区.
目的:探讨乙型肝炎病毒(HBV)基因组存在前-X基因.乙型肝炎病毒(HBV)基因组内部结构基因与编码基因之间相互重叠,是基因组序列高度集中利用的一个典型.早期研究中确定了编码病毒蛋白的4个开放读码框架(ORF),本研究通过对于中国HBV感染者的流行病毒株的基因序列进行分析比较,阐明基因组结构的特点,并探索是否存在新型ORF的可能性.方法:考虑到HBV基因组序列的准种特点以及多聚酶链反应(PCR)技术的精确度,我们采用的技术是长距离且精确PCR(LA-PCR)技术,根据中国HBV患者的病毒基因序列设计PCR扩增用引物,自慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列,克隆入pGEM Teasy质粒,挑选克隆进行全基因组DNA测序,与其他HBV基因组序列进行比较.结果:测序结果提示来源于2个患者的5株HBV全基因组核苷酸序列在X基因之前存在一ORF,我们命名其为前-X(pre-X)区.前-X区编码氨基酸与X蛋白融合表达,序列为MGLGYWPSPPAWNLCGSSADPYCGTPSSLFCSQPVWSETYRNRQLCCPLSQIHLLS.该编码序列仅在adr血清型中有编码表现.结论:在HBV基因组中存在有一新的ORF,命名为前-X区,该区可能是一种HBV血清型特异性编码区.
全球乙型肝炎病毒(HBV)感染人群为1.7亿人.1992年我国将乙肝疫苗接种纳入计划免疫管理,经过10余年的努力,普通人群的表面抗原的携带率从1992～1995年的9.75%下降到2004年的8.2%,但我国仍然属于高流行区.虽然多年来对于HBV及其致病特点进行了多方面的研究,目前的普通干扰素、聚乙二醇化干扰素、拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦等的临床抗病毒治疗也取得了显著的进展,但是关于HBV及其致病特点的认识,还有很多未知领域,或没有进行系统研究的课题.HBV准种特点的研究就是其中之一.
乙型肝炎病毒(HBV)的感染引起的急性和慢性病毒性肝炎、肝硬化(LC)、肝细胞癌(HCC)的治疗十分困难,主要是由于我们对于HBV的分子生物学特性以及HBV相关性肝脏疾病的发病机制的认识还存在许多问题和误区.我们都知道,不同患者血清中的HBV不同拷贝之间的核苷酸序列不同,并就此分成不同的血清型和基因型.但是,对于一个特定患者来说,血清中的HBV DNA拷贝数目巨大,不同拷贝之间的序列是否相同,是否对于临床疾病状态和临床抗病毒治疗产生影响,多年来我们相对忽视这一问题.HBV分子生物学研究的结果提示,我们必须重视每一例患者血清中HBV核苷酸序列的这种异质性,特别是HBV的准种特点.
