建立非还原SDS-PAGE纯度检测方法,以研究康柏西普降解物或片段的含量.本文针对凝胶的筛选、凝胶成像系统的比较、主带灰度值线性范围和脱色条件开展研究,确定了康柏西普非还原SDS-PAGE纯度测定方法的实验条件.结果显示:4％～15％梯度浓度胶分离效果好,带型清晰平整;高分辨率的凝胶成像系统能使主带、杂带响应峰基线分离;当上样量≤3 μg时,主带灰度值线性好,因此,以3 μg作为非还原SDS-PAGE纯度方法的上样量;脱色条件确定为60 min更换一次脱色液,每次100 mL,脱色时间不超过3h.所建立的非还原SDS-PAGE纯度测定方法能够更客观测定康柏西普的纯度,该方法经过验证后,以补充材料的形式提交美国FDA,为康柏西普在美国直接进入临床Ⅲ期研究奠定了质量基础.
盐酸组氨酸和谷氨酸是<中国药典>2010年版二部收载的氨基酸类药物,且二者均收载于<英国药典>和<欧洲药典>.盐酸组氨酸收载于<美国药典>,<日本药局方>未收载这两个品种.<中国药典>2005年版二部收载的这两个品种的其他氨基酸检查项下均无系统适用性要求[1-2],2010年版增加了系统适用性要求[3-4],但是,系统适用性试验结果都存在一些问题,前者的系统适用性结果是脯氨酸的斑点不够清晰,加大上样量后斑点清晰度提高；后者系统适用性结果是门冬氨酸的斑点不显色,无法判定系统适用性是否符合要求,增加门冬氨酸浓度后斑点显色明显,为此笔者认为对系统适用性溶液的配制及点样量提出商榷.
制备薄层色谱法是一种有效的分离提纯方法.它可以从复杂的混合物中分离制备化合物纯品.制备薄层色谱法一般是用于分离几十毫克至几百毫克的样品.目前制备薄层色谱法有微量吸管法、融污斑点法、接触加样法、热微量转移技术及滤纸移样法等上样方式.但这些上样方式均属液体上样法,存在着上样量小、费时、色谱带宽或者是技术复杂等一些弊端.本文提出了一种新的上样方法-固相上样法,即将固体样品直接上样.本法改变了传统的上样方法,克服了传统上样方式的许多缺点.下面以2,6-二氯二苯胺的薄层制备来详细说明这一方法.
传代Vero细胞狂犬病疫苗较原代地鼠肾细胞狂犬病疫苗具有效价高,工艺简单,无外源因子污染,易于大规模生产的优点.其浓缩液经过Sepharose 4FF凝胶柱层析纯化后[1],其杂蛋白去除率可达99%以上,一、二期临床试验证明副反应率极低,且免疫效价可达4.5IU/ml以上,高于<中国生物制品规程>所规定的2.5IU/ml要求.在深入研究纯化工艺最佳条件时,发现待纯化的浓缩疫苗上样量的多少直接影响纯化后疫苗的质量.对此,我们做了研究,结果报告如下.
目的: 运用二维电泳(2-DE)技术分离人类正常精子低丰度蛋白并建立全精子蛋白的2-DE整合图. 方法: 30例精子标本混匀后一次性进行蛋白提取,分别使用0.8、0.6、0.5、0.3 mg的蛋白上样量进行2-DE.运用MALDI-TOF法对确定2个恒定蛋白点的等位点(PI)和相对分子质量(Mr)作为图像的内参照点,对不同上样量的2-DE图进行比较分析,最后合成1张富集低丰度蛋白的整合图. 结果: 在0.5 mg图中分离出(1 080±23)个蛋白点,并合成具889个匹配点的整合图A.在上样量为0.8、0.6及0.3 mg的2-DE图中,分别新检测到381、50、32个在0.5 mg图中未检测到的蛋白点.最后合成具1 352个蛋白点的整合图B. 结论: 通过改变上样量的方法促进低丰度蛋白分离并合成具1 352个蛋白点富集低丰度蛋白的2-DE整合图.
经过Sepharose 4FF凝胶柱层析法[1]纯化的人用地鼠肾细胞狂犬病疫苗,其杂蛋白去除率可达99%以上,副反应率较现行的3-5倍浓缩疫苗明显降低,且免疫效价可达3.7IU/ ml以上,值得大力推广并最终取代浓缩疫苗.在深入研究纯化工艺最佳条件时,发现待纯化的浓缩疫苗上样量的多少直接影响纯化后疫苗的质量,研究结果表明,上样量为柱床体积的 10%以下时,纯化效果最佳.
