聚合酶链反应或多聚酶链反应(polymerasechain reaction,PCR)检测技术,又称体外基因扩增技术,最早由美国Cetus公司的Kary Mullis及其同事于1985年发现并研究成功.它是通过聚合酶促寡核苷酸引物的延长,反复循环,使目的DNA成指数扩增,是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的新方法,也是体外酶促合成特异DNA片段的新方法.经过PCR过程,可在数小时内使几个拷贝的DNA序列扩增107-109倍.它已广泛应用于基因分离、基因克隆、核酸序列分析和测序,应用于研究基因表达和调控、基因多态性分析以及探讨基因与疾病等生物医学体外检测的各个领域.
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV) 是一种可导致多种疾病的DNA病毒.自Lohr等[1]发现HCMV与2型糖尿病有关以来,HCMV与糖尿病的关系已被重视.为此,我们自行设计并合成对HCMV基因组特异和保守的寡核苷酸引物对,建立了套式逆转录聚合酶链反应(套式RT-PCR)方法,检测糖尿病患者外周血单个核细胞(PBMC)中HCMV-mRNA的表达,探讨糖尿病患者HCMV活动性感染状况及临床意义.
铜锌超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)因为可以消除O2·-而被广泛应用于延缓衰老和控制炎症,但是由于多种因素影响,尤其是Cu,Zn-SOD具有种质特异性以及在体内停留时间短(通常只有6～10 min),使得Cu,Zn-SOD的应用受到很大限制.定点突变技术是改造、优化基因常用的手段,也是研究蛋白质结构和功能之间复杂关系的有效方法,在医学上还可用于基因治疗等.目前常用的定点突变方法有寡核苷酸引物介导的定点突变、重叠延伸PCR定点突变及盒式突变等[1].但由于这些方法操作繁琐,意外突变多等缺陷,使定点突变的实验受到一定限制.本研究采用一种近年来新的定点突变技术一快速PCR定点突变方法成功地对hCu,Zn-SOD进行了基因改良(将hCu,Zn-SOD基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码子,以提高其稳定性),同时对该定点突变技术要点进行探讨.
目的:结核病疫情再度增高给结核病的防治提出了新的挑战,由于卡介苗对结核病的预防效果极不稳定,发展新型结核病疫苗势在必行,本研究通过对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行克隆与表达研究,旨在为结核病新型疫苗研制提供新的靶点.方法:根据结核杆菌H37Rv株免疫保护性抗原Ag85A的基因序列自行设计一对寡核苷酸引物,以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板通过PCR扩增获得具有完整开架读码框(ORF)的Ag85A抗原基因,并将其正向插入真核和原核穿梭表达型载体pBKCMV构建重组质粒,重组质粒转入大肠杆菌后IPTG诱导表达,并对其表达产物进行Western-blotting分析.结果:①PCR扩增获得了具有完整开架读码框的Ag85A抗原基因;②构建了Ag85A抗原基因真核和原核穿梭表达型载体;③Ag85A抗原基因在大肠杆菌中实现了稳定表达.结论:本研究成功地对结核杆菌免疫保护性抗原Ag85A进行了基因克隆与表达,为进一步研究其在结核病新型疫苗研制中的应用奠定了基础.
在过去20年里,临床真菌感染日益增多,院内感染率由2%增至3.8%,其中尚不包括大量未能明确诊断的真菌感染者.国内情况更为严重,真菌的感染率增加了40倍,且住院患者中伴真菌感染者死亡率明显高于无真菌感染者,分别为29%和17%[1].目前临床常用的检测方法为直接涂片法及培养法,直接涂片法简便、快捷,但检出率低,对体液尤其是血液标本的检出较困难,培养技术检测阳性率也不高,而且检测时间长,难于满足临床早期、快速诊断的需要,因此迫切需要一种快速、简便、高特异性、高灵敏度并且适合各种检测样本的检测方法.真菌18sRNA基因区为真菌共有的保守区,我们在此基因区设计了一对寡核苷酸引物,建立了真菌的PCR检测方法,现介绍如下.
