艾滋病病毒(HIV-1)中的Nef蛋白具有重要的维持患者病毒高载量、加快疾病进展、下调CD4、主要组织相容性复合物(MHC)等多种分子,增强病毒的复制能力和感染性等多种功能.然而,20多年来,Nef蛋白增加病毒感染性的机制并不清楚.最近的进展表明,人体细胞膜跨膜蛋白丝氨酸整合因子3和5(serine incorporator 3,SERINC3 andSERINC5)具有重要的抗病毒作用,而HIV-1编码Nef蛋白拮抗这一作用.
从含人类免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)Bostwana C亚型全基因的质粒pJM4-HIV中克隆了nef基因,并利用非复制型痘苗病毒载体构建表达Nef蛋白的重组病毒NTVJ1175nef,经PCR和Southern blot鉴定,nef基因正确整合到痘苗病毒基因组的J片段上;感染人源细胞后,经Western blot和免疫荧光检测表明,重组病毒能很好地表达Nef蛋白,并定位于细胞质中.NTVJ1175nef免疫BALB/c小鼠后,经Pep-IFN-'γ-Assay法检测,可诱导产生针对表位肽P1特异的可分泌IFN-'γ的C+8 T细胞(占脾细胞总数0.20%);经乳酸脱氮酶(LDH)法检测证实,诱导的细胞毒性T细胞(CTL)可特异性地杀伤表位肽P1特异P815靶细胞.这些结果表明,NTVJ1175nef具有良好的细胞免疫原性,为下一步构建表达包含HIV早期抗原的多组分重组痘苗病毒候选疫苗奠定了免疫学基础.
目的表达人免疫缺陷病毒1型C亚型调控蛋白Nef,为研制HIV疫苗寻找新的途径.方法通过PCR扩增,获得HIV-1 C亚型Nef基因片段,并将其克隆到原核表达载体pGEX-5X-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达后,以SDS-PAGE和Western blot分析表达产物.结果表达产物是相对分子质量为50 000的GST融合蛋白,且能与p27单克隆抗体发生特异性反应.结论重组Nef蛋白在大肠杆菌中得到了有效表达.
目的 原核表达HIV-1 CN54调控蛋白Nef,并进行纯化、复性及鉴定.方法 将CN54 Nef基因克隆至pThioHisA载体,构建非融合表达载体,转化大肠杆菌BL21 Codonplus-RIL,IPTG诱导表达,通过尿素梯度洗涤包涵体纯化Nef蛋白,透析复性.Western blot检测目的蛋白的特异性.结果 Nef蛋白以包涵体的形式表达,表达量占菌体总蛋白的40%以上.用尿素洗涤法可直接纯化Nef,纯度达到90%以上.Nef蛋白透析后溶解于PBS缓冲液中.Western blot检测显示了良好的特异性.结论 HIV-1 CN54 Nef抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达,采用的纯化和复性Nef蛋白的工艺简便、快捷,为开发针对Nef基因的HIV-1疫苗奠定了基础.
目的 探讨HIV-1 B'亚型毒株感染者Nef蛋白细胞毒性淋巴细胞(cytotoxicT lymphocyte,CTL)表位变异及其与病毒载量的相关性.方法 从137例HIV-1 B'亚型毒株感染者的血浆样本中提取病毒RNA,经逆转录及巢式PCR扩增获得Nef基因并测序,将获得的Nef基因序列翻译为蛋白序列,然后与HIV免疫学数据库中经过实验证实的CTL表位进行比对,分析Nef蛋白CTL表位变异与感染者病毒载量的关系.结果 与HIV免疫学数据库中CTL表位的比较发现,本研究137例HIV-1 B'亚型毒株感染者病毒Nef蛋白大部分CTL表位相对保守,只有5个表位的变异频率超过10％,CTL表位旁序列的变异程度较锚着位点变异大,表位旁上下游第一位氨基酸的突变频率较高,表位氨基酸总变异频率、锚着位点和表位旁序列的氨基酸变异频率与病毒载量呈正相关,非锚着位点氨基酸的变异与病毒载量无相关性.结论 HIV-1 B'亚型毒株感染者Nef蛋白大部分CTL表位较保守,CTL表位旁序列变异程度较锚着位点大,表位旁上下游第一位氨基酸的突变频率较高,推测表位旁序列氨基酸的变异可能是Nef蛋白CTL逃逸突变的主要方式,Nef蛋白CTL表位变异与病毒适应性损伤的关系还需进一步研究.
目的 分析HIV-1 B'亚型毒株Nef蛋白重要功能区及CTL表位氨基酸序列变异特征.方法 从137例HIV-1感染者的血浆样本中提取病毒RNA,进行逆转录获得cDNA,再经巢式PCR扩增全长Nef基因并纯化测序.利用BioEdit、Mega6.0软件分析所获得的Nef基因重要功能区的氨基酸变异,并比较所获得的Nef基因共享序列与我国B亚型Nef共享序列及国际B亚型Nef共享序列的CTL表位情况.结果 HIV-1 B'亚型毒株Nef蛋白N端豆蔻酰化信号区、蛋白酶加工区、酸性区、Pak结合区、PxxP区等功能区氨基酸序列较为保守,但有3个功能区中存在变异率大于30％的氨基酸位点,其中长度可变区的21号密码子上的R被E//K/Q取代的变异率达56.21％(R21E 24.09％,R21K 19.71％,R21Q 12.41％),COPI结合区EE154-155的E154被K取代的变异率为32.85％,双亮氨酸基序ExxxLL160-165的S163被C取代率为30.66％.本研究所得的137条Nef蛋白的共享序列的CTL表位与我国HIV-1 B亚型的共享序列CTL表位一致,而与国际B亚型共享序歹列相比有两个肽段表位的氨基酸发生了变异.结论 HIV-1 B'亚型毒株Nef蛋白多数重要功能区及CTL表位的氨基酸序列较保守,但有3个功能区存在变异率大于30％的氨基酸位点,这种特性可能影响病毒致病作用.
