细胞色素P450(CYP450)是一类超基因家族编码的单加氧酶,参与萜类、生物碱和甾醇类等多种次生代谢产物的合成与代谢.CYP450对人参皂苷三萜碳环骨架进行羟基化和氧化等一系列复杂修饰作用,是人参皂苷生物合成途径中的关键酶.近年来利用新一代测序技术及生物信息学分析等方法,从CYP450家族中筛选出参与人参皂苷生物合成的相关CYP450s,并对候选基因(CYP716A47)进行了生物功能验证,进一步阐明了人参皂苷合成途径.本文对人参皂苷生物合成途径做简要介绍,并对近年来CYP450在人参皂苷生物合成途径中的研究进行综述,为阐明人参皂苷合成途径及通过基因工程手段合成人参皂苷提供理论依据.

酮类化合物是藤黄属植物中的主要特征成分，具有多样的生物活性，在中国藤黄属植物中广泛分布。由于氧化程度、取代基种类、数量和取代基位置的不同，酮类化合物具有多样的结构类型。文章综述了中国藤黄属植物中酮类化合物的研究概况，总结了该类化合物的分布、提取分离、结构分类、波谱学特征和生物合成途径。

目的:克隆冬凌草二萜类化合物生物合成途径下游关键酶基因IrCYP71,进行序列特征分析,对此基因编码的蛋白进行原核表达分析以及亚细胞定位,并对蛋白在宿主细胞表达的条件进行了优化.方法:根据转录组测序所得的IrCYP71基因片段,克隆出全长cDNA序列;构建pET28a(+)-IrCYP71重组质粒,转化到Rosetta感受态细胞,小量表达和大量表达蛋白并鉴定,进行包涵体蛋白的纯化与复性,再对复性蛋白纯化鉴定分析.基于gateway克隆技术构建出PCR8/GW/TOPO-IrCYP71载体之后与改造Pearleygate104载体重组,之后与农杆菌GV3101重组,转入烟草中瞬时表达,从而进行蛋白亚细胞定位.结果:克隆得到的IrCYP71基因全长cDNA为1 593 bp,编码530个氨基酸,并在GenBank注册(登录号MG800628).经大肠埃希菌表达系统表达的重组蛋白相对分子质量正确,在62 kDa左右,纯化后的重组蛋白总量有1 mg,蛋白纯度为85％.此蛋白亚细胞定位在细胞核.结论:对冬凌草IrCYP71基因进行了初步验证,并对基因表达的蛋白进行原核表达和亚细胞定位,使该基因在冬凌草二萜成分的生物合成过程中的作用得到了进一步的阐述.

通过阐明并模拟中药活性成分生物合成的基本规律,人工设计并构建新的、具有特定生理功能的生物系统(药用植物或微生物系统),这种中药合成生物学研究策略,将是一种极具潜力的中药活性成分资源获取方法.丹参酮是丹参中一类具有显著药理活性的二萜,该文系统介绍了丹参酮合成生物学研究进展,旨在为其他中药萜类活性成分研究提供借鉴,为中药资源可持续利用研究提供新的研究策略.

穿心莲内酯是穿心莲的主要药效成分,广泛用于抗炎.为了对它的生物合成进行遗传调控,提高内酯类成分的合成量,作者在转录组数据分析的基础上,获得了穿心莲内酯生物合成途径中甲羟戊酸5-焦磷酸脱羧酶基因的3个克隆,包含的ORF均长1260bp,分别在4个位点具有单碱基的差异.它们编码由419个残基组成的氨基酸序列;保守结构域中均具有11个高度保守的氨基酸,分别决定催化反应的特异性和活性;N端不含有质体定位的信号肽;与丹参的MVD蛋白(GenBank号AEZ55675.1)一致性较高.在穿心莲茎和叶片中,MVD基因的表达量分别在花蕾期和初花期最高,但各时期表达量的倍数差异不大.该研究获得的MVD基因,为后续进行详细的功能解析,并进一步应用于穿心莲内酯的遗传调控,奠定了基础.

道地药材一直是中药材的“品质标杆”,地位不可撼动.道地药材的品质形成从分子层面的基因遗传到最终产物的代谢表型都有涉及,其次生代谢产物的生物合成途径至今并未完全阐明.近年来,不断丰富的组学技术在揭秘复杂生物系统如何运作上功不可没,也同样适用于道地药材复杂的品质形成机制探索.为了缓解道地资源日益匮乏的现状,科学地指导优质品种的移栽,该文综述了组学在解读道地药材从基因到表型的变化过程、次生代谢产物的生物合成途径、与人体的相互作用和品质评价的新方法这些方面的研究成果,为更好地保护和利用中医药资源提供思路.

次生代谢产物是植物在其生长发育和对环境的适应过程中形成的,通常是药用植物中的主要活性成分,药材品质的物质基础.但次生代谢产物的生源途径复杂,其产生和积累受到自身遗传和环境中各种生物和非生物因素的调控,影响了药用植物作为药材的品质控制及其活性成分的开发利用.系统生物学思维与方法是系统全面探索生物的有力工具,随着现代分子生物学技术及生物信息学的发展,系统整合基因组、转录组、蛋白组和代谢组等组学技术,将为药用植物次生代谢产物研究带来新的机遇.这种整体、系统的研究方法在药用植物次生代谢产物形成的生物合成途径、信号转导、生态环境及其代谢工程等研究中的应用,构建次生代谢物生物合成基因表达调控系统模型,对于系统阐释药用植物有效成分成因和道地药材形成机制、代谢工程产生药用植物活性成分、和药用植物资源合理开发利用等具有重要意义.

穿心莲内酯为传统中药穿心莲中的主要有效成分,具有多种药理活性,广泛运用于临床,但其生物合成途径尚未被解析.细胞色素P450还原酶为CYP450提供电子,在CYP450的催化过程中起重要作用.该研究通过同源比对筛选并克隆了 穿心莲CPR的编码序列,命名为ApCPR4.原核表达ApCPR4蛋白,分离纯化后进行体外酶活鉴定,发现ApCPR4能够以NADPH依赖性方式还原细胞色素c和铁氰化物.为了验证其体内功能,将ApCPR4与CYP76AH1共转化入酵母工程菌,结果表明,ApCPR4在酵母体内能够协助CYP76AH1催化生成铁锈醇.实时定量PCR结果显示,在茉莉酸甲酯(MeJA)处理的叶片中,ApCPR4的表达量逐渐增加.该表达模式与穿心莲内酯受MeJA诱导积累的趋势一致,推测ApCPR4与穿心莲内酯的生物合成相关.

以长春花为研究对象,分析其密码子使用偏好性,以期为相关基因的异源表达、基因的预测、物种的进化研究提供指导.该研究以长春花的30 437条蛋白质编码序列为数据来源,对长春花密码子组成和密码子偏性的各项参数进行了计算和统计分析.计算了长春花萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids,TIAs)生物合成途径中25个关键酶基因含有大肠杆菌或酿酒酵母稀有密码子的比例.结果显示,长春花基因的平均GC量为42.47％,密码子第3位碱基平均GC量为35.89％.长春花中共有28个密码子的同义密码子相对使用度(relative synonymous codon usage,RSCU)大于1,其中26个以A或T结尾.25个关键酶基因含有大肠杆菌稀有密码子的比例明显高于酿酒酵母稀有密码子的比例.长春花主要偏爱使用以A和T结尾的密码子;相比于酿酒酵母,其密码子使用特点与大肠杆菌的差异更大,推测酿酒酵母可能是长春花基因更合适的异源表达宿主.

目的 改造大肠杆菌色氨酸生物合成的中心代谢途径,以进一步提高色氨酸产量.方法 根据ppsA和tktA基因序列分别合成引物行PCR扩增,将PCR扩增所得PLacO1-tktA-T1片段和pZA31质粒连接,经筛选鉴定正确的pZA31-tktA重组质粒和PCR扩增所得PLacO1-ppsA-T1片段连接,构建pZA31-ppsA-tktA重组质粒,并进行测序鉴定.将鉴定正确的pZA31-ppsA-tktA和pZE12-arofbr-trpEDfor重组质粒共转化至E.coli MGl655ART-R,获得的重组菌株命名为E.coli MG1655△RT-R[pZA31-ppsA-tktA/pZE12-aroGfbr-trpEDfbr](工程茵);以pZEl2-aroGfbr-trpEDfbr重组质粒转化至E.coli MGl655ART-R得到的重组菌株E.coli MG1655△RT-R[pZE12-aroGfbr-trpEDfbr]作为对照菌株,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,3 h后收集部分菌体行ppsA、tktA酶活性测定,其余发酵液继续培养4-5h后,监测调整培养基中葡萄糖浓度和pH值保持不变,48 h后检测色氨酸产量.结果 PCR扩增所得片段均与预期DNA表达片段大小一致;pZA31-ppsA-tktA重组质粒测序显示,克隆的tktA和ppsA基因序列与报告序列完全相同.工程菌ppsA和tktA酶活性(U)与对照菌株比较,分别提高了3和3.5倍(分别为0.25±0.04 vs.0.08±0.02,P<0.05:0.21±0.03 vs.0.06±0.02,P<0.05);色氨酸产量(g/L)与对照菌株比较,提高了13倍(1.10±0.05 vs.0.80±0.05,P<0.05).结论 成功改造了大肠杆菌色氨酸生物合成的中心代谢途径,进一步提高了色氨酸产量,为构建高产色氨酸基因工程菌打下了基础.

单克隆抗体是复杂的四聚体糖蛋白，常呈现微观不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构体[1]。这些异构体可能来自于抗体分子复杂的生物合成途径，如细胞系及培养工艺[2]，也可能来自于纯化、制剂等制造过程以及贮存过程的任何阶段[1]。其中由于抗体分子所带电荷差异造成的异质性称为电荷异构体，一般分为酸性异构体和碱性异构体，产生原因主要与翻译后修饰有关。电荷异构体宏观表现为在等电聚焦电泳图上出现弥散或多个条带；离子交换色谱图主峰前后出现小峰。由于这些异构体可能会影响抗体的稳定性、药效、免疫原性或药代动力学，特征性地识别和分离电荷异构体是至关重要的。基因泰克公司曾对上市抗体及临床前抗体药物关于电荷变化产生的药效、药代等方面的影响做过一个总结，结果表明：①当电荷变异超过一个 pH单位时，会影响药物的组织分布及药代动力学；②增加正电荷，会提高药物的组织停滞，降低血液清除；③降低正电荷，会减少药物的组织停滞，提高药物的全身清除[3]。因而分离电荷异构体，得到均一性质的抗体是一个关键的挑战，尤其在生物类似物开发过程中应尽可能控制异构体含量与原研药保持一致。

鸟氨酸脱羧酶(ODC)是多胺生物合成途径的关键酶.ODC异常高表达及细胞内多胺高水平与肿瘤发生发展密切相关[1].我们采用体外实验方法对ODC 抑制剂二氟甲基鸟氨酸(DFMO)阻断人膀胱癌EJ细胞多胺生物合成途径对细胞生长及凋亡的影响进行观察.

鸟氨酸脱羧酶(ODC)是多胺生物合成途径中的关键酶和限速酶.许多肿瘤促进剂、诱导剂在诱发组织癌变的过程中,伴有ODC活性的异常升高,在一些癌基因转化的细胞系及几乎所有的动物肿瘤中,也有ODC基因表达的异常[1].ODC作为多胺生物合成途径中的第一个限速酶,也是活性最低的酶,可催化L-鸟氨酸生成腐胺.有报道,ODC的含量在许多肿瘤中增高,并与肿瘤的复发有一定的关系[2].

卟啉病是由于血红蛋白生物合成途径中特异酶缺乏，所致的一种卟啉代谢紊乱病。

一、白三烯(Leukotrienes,LTs)生物合成及生物学效应的研究进展1.LTs的跨细胞合成:LTs由细胞膜和核膜的脂质双层在磷脂酶A2作用下产生花生四烯酸(AA),AA经5-脂氧酶(5-lipoxygenase,5-LO)途径代谢生成LTs,LTs的生物合成途径见图1.由于白三烯C4(LTC4)、白三烯D4(LTD)和白三烯E4(LTE4)均含有半胱氨酰基,因而被统称为半胱氨酰白三烯(Cysteinyl leukotrienes,CysLTs).多种细胞参与LTs的合成过程,包括中性粒细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞(EOS)、肥大细胞和嗜碱性粒细胞甚至气道结构细胞,不同的细胞合成LTs的方式、种类和数量各异.

植物二萜类化合物广泛存在于自然界中,是一类重要的天然化合物.随着一些具有重要经济价值的二萜不断被发现,其生物合成中的二萜合酶也倍受关注.二萜合酶催化活性的多样性决定了终产物(二萜化合物)的丰富性.本文重点探讨了近年来二萜生物合成途径和二萜合酶的类型、克隆、催化机制及其合成生物学应用等研究进展.

紫杉醇是一种抗癌新药.紫杉醇及其衍生物还具有防治移植动脉硬化、抗瘢痕形成和抗血管生成等功能.目前,人们获得紫杉醇的方法主要有以下几种:直接从红豆杉中提取;化学全合成;化学半合成;细胞培养;内生真菌提取培养及代谢工程生产紫杉醇.已从红豆杉中克隆出了至少14个和紫杉醇生物合成相关的基因并进行了功能鉴定.紫杉醇生物合成途径的阐明带动了紫杉醇前体组合表达系统的研究.

从中国南海高领类尖柳珊瑚(Muriceides collaris Nutting)中分离得到了7个愈创木烷型倍半萜:1个新化合物6-formyl-5-isopropyl-3-hydroxymethyl-7-methyl-1 H-indene (1)、1个新天然产物5-isopropyl-3,7-dimethyl-1H-indene-1-one (2)及5个已知化合物:guaiazulene (3)、4-formyl-7-isopropyl-10-methylazulene (4)、sesquiterpeneketolactone (5)、alismoxide (6)和guaia-1 (5),6-diene (7).化合物的结构通过现代波谱技术[MS、IR、1H NMR、13CNMR(DEPT)、HMQC、HMBC、NOESY]及与文献对照得到了确证.

为研究商陆皂苷甲的生物合成途径,利用Illumina HiSeq 4000高通量测序技术对商陆幼苗进行转录组测序,得到9.60 Gb clean data,经Trinity软件组装后获得63 957条unigenes,平均长度988.82 bp,其中24 517条unigenes (38.33％)能被Nr、Swiss-Prot、COG、KOG、Pfam、GO、KEGG等公共数据库注释.对注释得到的unigenes进行KEGG代谢通路分析,发现商陆转录组中有53个unigenes参与萜类骨架合成通路,有8个unigenes参与三萜合成通路,还有417个unigenes参与商陆其他次生代谢途径.进一步分析参与商陆皂苷甲生物合成后修饰酶相关基因,发现有130个unigenes可能具有CYP450的功能,参与商陆次生代谢产物的氧化/羟基化修饰;有46个unigenes与糖基转移酶UGT相关.商陆转录组数据的获得为研究商陆皂苷甲和其他次生代谢产物的生物合成途径奠定了基础,也为商陆药材品质的形成提供理论依据.

目的 研究九节菖蒲(Anemone altaica Fisch ex C.A.Mey)中的酚酸类化学成分.方法 采用Diaion HP-20大孔吸附树脂,Sephadex LH-20凝胶,硅胶等柱色谱技术并结合制备液相对九节菖蒲水溶性成分进行分离纯化,通过理化性质和波谱数据结合文献对化合物结构进行鉴定,对分离得到的新化合物来源进行了推测,同时分析了酚酸产物的生物合成来源.结果 从九节菖蒲水溶性部位分离并鉴定了11个化合物:阿魏酰酒石酸甲酯A(Ⅰ),阿魏酰酒石酸甲酯B(Ⅱ),阿魏酰酒石酸乙酯B(Ⅲ),阿魏酰乳酸单甲酯(Ⅳ),阿魏酰乳酸二甲酯(Ⅴ),香草酸葡萄糖苷(Ⅵ),对羟基苯甲酸葡萄糖苷(Ⅶ),绿原酸甲酯(Ⅷ),3-O-阿魏酰-奎宁酸(Ⅸ),5-O-feruloyl-3-O-(β-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-D-ribono-γ-lactone(Ⅹ),carboxymethyl isoferulate(Ⅺ).结论 化合物Ⅰ～Ⅴ为新化合物,推测其为人工产物,化合物Ⅵ～Ⅺ为从该植物首次分离得到.

本刊讯前不久，中国科学院大学武汉植物园硕士研究生周晨以白桦树树皮为研究材料，从中分离了控制白桦脂酸合成的关键细胞色素氧化酶基因并在微生物酵母细胞中人工重建了白桦脂酸生物合成途径。

1.内容简介:本成果涉及利用基因重组技术研制新抗生素-丙酰螺旋霉素及对其他抗生素结构改造的探讨.本研究的总体思路是在大环内酯类抗生素生物合成途径的基础上,对其结构进行改造以提高其体内活性,并简化生产工艺.具体目标是利用基因重组技术使螺旋霉素4"-OH丙酰基化.根据报道,螺旋霉素4"酰基碳链延长可以提高螺旋霉素的脂溶性,并增强其在体内的活性.为此,我们利用与螺旋霉素生物合成途径相似的16元环大环内酯抗生素-麦迪霉素,将其4"丙酰基转移酶基因克隆,然后转入螺旋霉素产生菌中使之表达.经发酵、提取、纯化及多种光谱(紫外、红外、质谱、高压液相、1H、13C核磁共振等)鉴别,确证其主要产物为4"-丙酰螺旋霉素Ⅲ,Ⅱ.现已证明丙酰螺旋霉素为新的有效抗生素.

天然药物化学是高等中医药院校药学专业的主干课程之一,是一门运用现代科学理论与方法研究天然药物中化学成分的学科.是药学课程体系中沟通传统中医药理论与现代科学技术的桥梁,在中药现代化、国际化进程中发挥着不可替代的作用,是创新药物研发的重要途径.天然药物化学的研究范围包括有效成分的化学结构、物理化学性质、提取、分离、检识、结构鉴定或测定、生物合成途径和必要的结构改造.

紫杉烯合成酶(taxadiene synthase)是抗癌药物紫杉醇生物合成途径的第一个酶,也是关键酶,在红豆杉植物体内催化生成紫杉醇的母核--紫杉烯;它在植物体内低水平的表达和低酶活力被认为是紫杉醇在植物体内含量低微的重要因素.Wildung等已经得到了太平洋红豆杉(Taxus brevifolia)紫杉烯合成酶的cDNA及其核苷酸顺序,长度为2 700 bp,开放阅读框架为2 586 bp,其中包括编码137个氨基酸残基的质体转移肽和725个氨基酸残基的紫杉烯合成酶肽链.我们过去的研究得到一中国红豆杉(T.chinensis)高产紫杉烷类化合物的愈伤组织细胞系,并构建了它的cDNA文库,克隆载体为λgt10.

喜树碱是我国特有植物喜树中分离得到的具有显著抗癌活性的重要次生代谢产物,利用生物技术大量生产喜树碱类抗癌药物是目前研究的热点.喜树碱生物合成途径是多酶催化的复杂过程,阐明喜树碱的生物合成机制,对应用代谢工程的策略调控代谢流量,使次生代谢朝喜树碱合成的方向进行至关重要.喜树碱有着与其他萜类化合物相同的上游合成途径,以及广泛的药物来源,因此弄清喜树碱合成机制对理解整个植物次生代谢的网络调控也具有重要意义.综述喜树碱的生物合成途径、相关酶及其表达调控,并对喜树碱的合成研究进行展望.

抗原刺激动物免疫系统产生抗体,抗体识别抗原的部位在其重链和轻链的可变区(variable region).如果将抗体的可变区(VH和VL)通过弹性多肽接头(peptide linker)稳定地连接在一起,即为单链抗体(single chain fragments variable,scFv).scFv大小仅为完整抗体的1/6,但其完全保持了抗体的抗原特异性及抗原的结合能力,同时由于为单链,在大肠杆菌或植物体内等容易表达,无须组装即能保持活性.在植物研究领域,其可用于植物病理诊断、植物生物活性成分的检测、定量分析与分离精制;而将单链抗体基因转入植物细胞,更可使转基因植物获得诸如增强对病毒、除草剂等的抗性,体内生理活性物质增加,次生代谢产物量提高等新的特性.特别是通过转入单链抗体基因,提高药用植物中具生物活性的次生代谢产物量的技术,可望发展成为一种新的分子育种方法,可以在不需要明了目标成分的生物合成途径的情况下,提高其产量.

环烯醚萜苷类化合物种类繁多,近年来对此类化合物的广泛研究发现其具有多种生物活性,如抗炎、抗肿瘤、保肝、心血管系统保护作用等.结合近年来国内外的研究,将其生物合成途径、相关酶(GPPS、GES、G10H、10-HGO、IS、7-DLS、7-DLGT、7-DLH、LAMT及SLS)及编码基因的研究进展进行综述,一方面可达到人为调节其代谢产物生成的目的,另一方面可为基于环烯醚萜苷类的新药发现提供参考.

三萜皂苷是一类重要的植物次生代谢产物,具有抗癌、抗病毒、降低胆固醇等药理作用.但三萜皂苷结构和生物合成途径复杂,在植物中的量低,提取成本高,因此对三萜皂苷生物合成途径研究并通过合成生物学等方法生产三萜皂苷已成为研究热点,合成生物学在三萜类药效成分或其前体的大规模生产应用方面具有广阔前景.综述了三萜皂苷生物合成途径、合成生物学及其在三萜合成方面的应用进展,探讨了三萜生物合成所面临的问题,并对合成生物学在医药领域的巨大潜力进行了预测.

丹参酚酸类成分为丹参治疗心脑血管疾病的主要有效成分,具有显著而确切的生物活性和药理作用.随着临床及市场对丹参酚酸类物质需求量的剧增,提高丹参中酚酸类成分的量及提升利用效率对其可持续发展具有重要意义.基于丹参基因组学、转录组学及代谢组学等方面近年来的研究进展,对丹参酚酸类成分的生物合成途径、关键酶基因与调控机制,以及丹参酚酸类成分生物转化利用现状等进行归纳分析,以期为丹参酚酸类物质资源的高效生产与资源综合利用提供科学依据.