背景: 2003年研究发现一个全新的Ⅲ型干扰素家族,即IFN-λs,包括λ1,2,3 三种亚型.目的;对在毕赤酵母中高效表达重组人干扰素-λ1(rhIFN-λ1)进行产率纯度分析.理化性质、受体表达鉴定以及抗肿瘤活性初步探讨.设计、时间及地点: 单一样本观察,于2006-09/2008-07在中国医学科学院基础所生物化学与分子生物学系完成.材料: 含rhIFNλ1表达质粒的酵母菌种pAO815-4 α F-IFNλ1/GS115,人宫颈癌细胞系Hela细胞和HCT116细胞,为中国医学科学院基础所医学分子生物学国家重点实验室保存.方法: 诱导含rhIFN-λ1表达质粒的甲醇营酵母Pichia pastoris进行表达,表达产物经阳离子交换层析及凝胶层析纯化.主要观察指标: 通过HPLC,质谱,毛细管电泳等鉴定其纯度及理化性质,反转录-聚合酶链反应及real-time荧光定量聚合酶链反应鉴定其在肿瘤细胞中特异受体的表达,应用四甲基偶氮唑盐比色法初步评价其抗肿瘤活性.结果: 毕赤酵母表达的rhIFN-1表达水平约9.23 mg/L,纯化后的纯度近90%.rhIFN-λ1等电点为8.01,相对分子质量为20 960.在Hela和HCT116中均检测到rhIFN-λ1受体小亚基IL-10R2和特片大亚基IL-28RmRNA的表达,但U937细胞中末检测到IL-28RmRNA的表达.rhIFN-λ1具有与IFN-α 2a相似的降低细胞增殖的作用,但在经检测无或极少表达IL-28R的细胞中此作用不明显.结论: rhiFN-λ1可以在毕赤酵母中实现高效表达,表达产物的理化性质与天然IFN-λ1一致,具有与IFN-α 2α相似的抗肿瘤活性,但对其特异受体分布少的骨髓造血系统降低增殖作用相对较弱.
巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris,Pp)表达体系是近年来刚发展起来的真核表达体系,其操作技术和酿酒酵母非常相似,相比而言Pp表达体系的应用还不够广泛,但这一体系已经显示出很好的优势和应用前景,已经成为目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一,广泛用于基因重组药物的表达.本文就采用这一表达体系表达外源蛋白所应考虑的因素进行综述.
从提取的HSV-1基因组中扩增得到编码gD蛋白胞外区1～314aa的基因gDt,将其插入毕赤酵母表达质粒pPIC9K的醇氧化酶(AOX1)启动子下游,构建携带gDt的重组载体,经电转化GS115菌株和G418筛选,得到了高效分泌表达gD蛋白的毕赤酵母菌株,表达量达到250mg/L,该目的蛋白可被gD单抗(1-I-9)特异性识别.表达产物经离子交换、金属螯合、分子筛柱层析纯化后得到纯度较高的重组蛋白.重组gD蛋白免疫BALB/c小鼠可诱生一定水平的特异性抗体,表明该蛋白具有较好的免疫原性,能够诱导小鼠产生体液免疫应答.
应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1 203bp.克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型.有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG分别为preS1,preS2,和S的翻译起点.然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将Sal I线性化的pPIC9K-preS质粒用电击法导入巴斯德-毕赤酵母GS115His-中.通过MD-G418平板筛选和5'AOX1和3'AOX1引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长preS基因的His+Mut+酵母工程菌株.此酵母菌株在合适的培养条件和甲醇诱导下高效表达产生全长PreS蛋白并可分泌到培养液中,SDS-PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的PreS蛋白能够与HBV抗体阳性血清发生特异性反应.
