目的 探讨阿霉素诱导人肾近端小管上皮细胞(HK-2 cells)损伤作用机制.方法 用刃天青试验法检测阿霉素0～100 μmol/L暴露HK-2细胞24h对细胞存活率的影响,并计算半数致死浓度(LC50);检测细胞培养上清中乳酸脱氢酶(LDH)含量以及细胞内Caspase-3/7蛋白活性的变化;用荧光显微镜观察细胞内磷脂质蓄积情况.结果 阿霉素暴露HK-2细胞24 h,可明显抑制HK-2细胞存活,且具有浓度依赖性(LC50=2.01±0.16 μmol/L);阿霉素可以引起HK-2细胞培养上清中LDH含量显著升高(P＜0.01),细胞内Caspase-3/7蛋白活性显著升高(P＜0.01),且细胞存活率与胞外LDH含量及胞内Caspase-3/7蛋白活性均呈现明显的负相关性(r2=0.986和r2 =0.991),LDH含量与Caspase-3/7蛋白活性呈现明显正相关性(r2 =0.999);荧光标记染色法观察到明显的细胞内磷脂质蓄积.结论 阿霉素可诱导磷脂质在HK-2细胞内大量蓄积,导致细胞膜受损和细胞功能障碍,以及引发细胞凋亡,产生细胞毒性.

目的 研究醋酸铅对人肾小管上皮细胞系HK-2细胞毒性剂量-反应关系及碘化钾(KI)的拮抗作用.方法 体外培养HK-2细胞分为不同剂量染铅组:分别加入浓度为0.2.5,5,10,20和40 μmol/L,的醋酸铅;KI干预组:加入终浓度为40 mg/L的KI、37℃孵育30 min后加入上述不同剂量的醋酸铅.染毒72 h后,利用噻唑蓝法(MTT)测定各组细胞的存活率;用相差显微镜观察细胞形态改变;Annexin-V/PI双染法检测细胞凋亡并用Hoechst33258染色、荧光显微镜观察细胞凋亡形态.结果 细胞存活率与醋酸铅浓度存在剂量-反应关系(r=-0.878,P＜0.01),其IC50为15.68 μmol/L;低剂量铅组部分细胞形态拉长呈长梭形,随着铅剂量增加,细胞变小、变圆,直至无完整细胞形态、细胞成团,脱壁漂浮;与对照组(0 μmol/L铅)比较,各种剂量铅染毒组HK-2细胞凋亡率明显增加(P＜0.05),凋亡细胞核染色加深呈高亮蓝色、模糊、核明显固缩和碎裂;各剂量铅组加40mg/L的KI,可使细胞存活率增加,IC50上升了3.33倍,细胞凋亡率下降,细胞形态改变明显改善.结论 醋酸铅对HK-2细胞毒性存在明显剂量-反应关系,KI可部分拮抗铅的细胞毒性.

目的 研究醋酸铅能否诱导人肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡,并探讨其凋亡机制.方法 平板克隆实验法检测细胞活力;Annexin V(膜联蛋白V)-FITC(异硫氰酸荧光素)/PI(碘化丙啶)双染法结合流式细胞仪分析细胞凋亡率;荧光化学分光仪分析caspase-3、-8.-9(半胱天冬酶-3、-8、-9)的活性变化;Western bolt(免疫印迹法)检测bcl-2、bax蛋白的表达.结果 铅可抑制HK-2细胞生长活力,随着铅浓度增高,细胞生长活力降低(P＜0.05,P＜0.01);铅使caspase-3、caspase-9的活性增强(P＜0.05,P＜0.01),但对caspase-8的活性无明显影响;caspase-3抑制剂可明显抑制铅诱导的caspase-3的活化,并抑制铅诱导的HK-2细胞凋亡;Western bolt结果显示铅染毒组HK-2细胞B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)蛋白表达降低,bax蛋白表达增高.结论 铅诱导HK-2细胞凋亡可能与铅增强caspase-3活性及抑制bcl-2蛋白表达有关.

目的 研究大黄素对人肾小管上皮细胞系HK-2细胞的毒性和细胞周期的影响.方法 体外培养HK-2细胞,利用噻唑蓝法(MTT)评价大黄素对HK-2细胞增长抑制的IC50,观察不同浓度药物对细胞形态和培养液乳酸脱氢酶(LDH)活力的影响,利用流式细胞仪检测大黄素对HK-2细胞周期的影响.结果 大黄素作用HK-2细胞48 h后,明显抑制细胞的增值,其IC50值为130.65 μmol/L,并且能够导致细胞发生皱缩和空泡化,LDH漏出率增加,同时对细胞周期产生阻滞作用,随着浓度的增高,G0/G1期细胞比例逐渐下降.而S期细胞明显升高.结论 大黄素在体外对于HK-2的增殖具有明显的抑制作用,而这种作用可能是通过改变了HK-2细胞正常的细胞周期来实现的.

目的 研究探讨黄芪注射液联合葛根素注射液减缓和治疗肾间质纤维化、保护并改善肾脏功能的相关机制.方法 以体外正常培养的人近曲肾小管上皮细胞(HK-2细胞)作为正常组、加入TGF-β1诱导刺激48小时的为模型组、加入黄芪注射液联合葛根素注射液与TGF-β1共培养48h的为治疗组,利用Real-time PCR技术分别检测a-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)、E-钙粘连素(E-cadherin)、转化生长因子-β1及其受体(transforming growth factor-β1/R,TGF-β1/R)、转导蛋白3/7(Smad3/7)、骨形态发生蛋白-7及其受体(bone morphogenetic proteins-7/R,BMP-7/R)和转导蛋白5(Smad5)的基因表达.结果 与模型组相比,黄芪注射液联合葛根素注射液的治疗组中α-SMA,TGF-β1/R和Smad3/7的表达明显下降,而E-cadherin,BMP-7/R和Smad5的表达显著升高.结论 黄芪注射液联合葛根素注射液可以延缓和治疗肾间质纤维化,并对肾脏起到保护作用,其机制可能与降低肾组织TGF-β1过度表达、阻断TGF-β1/Smads信号通路和增强BMP-7的表达、激活BMP-7/Smad5通路有关.

目的：考察商陆皂苷甲Esculentoside A（EsA）对人肾小管上皮细胞（HK-2细胞）的毒性。方法：1）MTT法测细胞活力；2）检测细胞上清液LDH、细胞内SOD及MDA；3）采用倒置显微镜及电镜观察细胞形态学；4）采用Hoechst-PI染色及流式细胞仪观察细胞凋亡的情况。结果：1）EsA对肾细胞的活力有显著的抑制作用，其IC50为149.11μg· mL-1，且存在一定的时效和量效关系；2）EsA能升高肾细胞培养上清中的LDH，使肾细胞内SOD/MDA比值有所下降；3）EsA能使肾细胞及其超微结构发生变化，出现凋亡或坏死，有一定的量效关系。结论：大于100μg· mL-1浓度的商陆皂苷甲对HK-2细胞有一定的毒性，其毒性机制与细胞氧化应激、凋亡等相关。

目的:研究大黄酸诱导人肾小管上皮细胞系HK-2细胞凋亡作用及其凋亡机制.方法:将密度为4×104个/mL的HK-2细胞悬液接种于96孔板,培养24 h后分别加入不同浓度大黄酸(0,25,50,100 μmol· L-1)作用12,24,48 h,MTT法检测大黄酸对HK-2细胞活性的抑制作用;利用Hoechst 33258染色法和流式细胞术检测大黄酸诱导HK-2细胞凋亡情况;实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测细胞原癌基因c-jun,活化转录调控因子2(ATF-2),半胱天冬氨酸酶3(Caspase-3)基因表达水平;Western blotting检测细胞磷酸化c-jun氨基末端激酶(p-JNK),c-jun氨基末端激酶(JNK),磷酸化p38丝裂原活化蛋白激酶(p-p38 MAPK),p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和活化型半胱天冬氨酸酶3(Cleaved Caspase-3)蛋白的变化,并利用JNK抑制剂SP600125,p38抑制剂SB203580进一步验证JNK和p38所介导的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号转导通路在HK-2细胞凋亡中的作用.结果:大黄酸能够呈剂量依赖性和时间依赖性抑制HK-2细胞活性.大黄酸作用下HK-2细胞凋亡率明显增加.大黄酸作用于HK-2细胞c-jun,ATF-2及Caspase-3基因的mRNA均明显上调;p-p38,p-JNK及CleavedCaspase-3蛋白表达显著性增加,JNK和p38总蛋白表达无明显变化.JNK特异性抑制剂SP600125与p38特异性抑制剂SB203580均能显著降低大黄酸诱导的HK-2细胞的凋亡率.结论:大黄酸能够诱导HK-2细胞凋亡,其作用机制可能是通过影响MAPK信号转导通路实现的.

目的:观察穿琥宁注射液(CHN)对小鼠肾毒性作用以及对HK-2细胞活性的影响.方法:50只ICR小鼠随机分为空白对照组、庆大霉素阳性对照组和CHN 150,1000,2000 mg·kg-1剂量组,尾静脉推注,连续7d,检测体重、肾脏系数、血清尿素氮、肌酐和肾脏组织病理等指标；另采用MTT法测定CHN干预后HK-2细胞的存活率,荧光染色法(吖啶橙)观察细胞核的形态变化,Annexin V/PI流式细胞术检测细胞凋亡率.结果:与空白对照组比较,阳性对照组血肌酐明显上升(P＜0.05)；CHN 2000 mg·kg-1组肾脏系数明显上升(P＜0.05),血肌酐、尿素氮明显上升(P＜0.05).组织病理学检查显示,CHN2000 mg· kg-1组具有肾节段性小管上皮细胞肿胀变性,甚至节段性肾小管变性坏死,伴少量矿物质沉积,部分小管扩张.此外,CHN对HK-2细胞增殖有抑制作用,在0.9～3.5 mmol· L-1浓度和8 ～48 h时间内CHN对HK-2细胞增殖有抑制作用.荧光染色和Annexin V/PI流式细胞检测结果CHN干预后HK-2细胞可见细胞出现形态不规则、核染色质固缩等细胞凋亡形态学的改变,并且细胞凋亡率随着剂量增加而增大.结论:CHN对小鼠肾脏具有毒性作用,作用可能是通过诱导HK-2细胞凋亡实现.

目的观察糖耐康对转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导的人肾小管上皮细胞(HK-2)对细胞外基质成分表达的影响,探讨糖耐康治疗肾间质纤维化的作用机制。方法将HK-2细胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培养基培养,并分为6组：空白对照组、TGF-β1诱导组(TGF-β110 ng/mL)、空白血清对照组(TGF-β110 ng/mL＋10%空白血清)、干预1组(TGF-β110 ng/mL＋5%糖耐康药物血清)、干预2组(TGF-β110 ng/mL＋10%糖耐康药物血清)、干预3组(TGF-β110 ng/mL＋20%糖耐康药物血清)。药物干预24 h,荧光定量PCR检测Ⅰ型胶原(ColⅠ)、Ⅲ型胶原(ColⅢ)和纤连蛋白(FN)的mRNA表达。结果 HK-2细胞经TGF-β1诱导后,ColⅠ、ColⅢ和FN的mRNA表达显著上升,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。经糖耐康药物血清干预后,其表达逐步下降,与TGF-β1诱导组比较,差异有统计学意义(P＜0.05)。而空白血清无此作用。结论糖耐康在一定程度上能够抑制TGF-β1诱导的人肾小管上皮细胞ColⅠ、ColⅢ和FN的mRNA表达,减少细胞外基质成分的分泌,具有防治肾间质纤维化的作用。

目的 观察化瘀降浊汤对转化生长因子(TGF)-β1诱导HK-2细胞发生上皮间质转分化(EMT)过程TGF-β/母系同源物家族Smad通路中关键因子E-钙黏蛋白(E-cadherin)、Smad3、蜗形蛋白(Snail)的影响,探讨其保护肾功能的作用机制.方法 MTT法测定不同浓度化瘀降浊汤对TGF-β1诱导HK-2的细胞增殖抑制率,计算半数抑制率(IC50).Westem blot和RT-PCR检测E-cadherin、Smad3、Snail蛋白和基因表达,间接免疫荧光检测E-cadherin蛋白表达.结果 化瘀降浊汤在一定浓度范围内抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞增殖,呈现出一定的量效关系,IC50为472.017μg/mL. Westem blot和RT-PCR检测结果显示,化瘀降浊汤中、高剂量组E-cadherin、Smad3、Snail蛋白和mRNA表达与诱导组比较,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01);免疫荧光检测结果显示,化瘀降浊汤能促进E-cadherin蛋白表达,与Western blot分析结果一致.结论 化瘀降浊汤可能通过调节HK-2细胞TGF-p/Smad信号途径中的关键蛋白达到抑制甚至逆转肾小管EMT,从而对肾小管间质纤维化起到保护作用.

用人肾小管上皮细胞(HK-2)评价泽泻萜类组分的肾毒性作用,同时探究其诱导HK-2细胞凋亡的作用,为存在争议的泽泻肾毒性研究提供参考.采用肾小管上皮细胞株,运用MTT比色法测定细胞活力,流式细胞术分析细胞凋亡,同时用Western blot检测HK-2细胞caspase-3,Bcl-2,Bcl-xl,Kim-1,clusterin,TFF-3蛋白表达水平,最后用q-PCR检测caspase-3,Bcl-2,Bcl-xl,Kim-1,clusterin,TFF-3 mRNA的表达.流式细胞仪检测结果表明,泽泻萜类组分(6.25×10-5,3.125×10-5,1.5625×10-5 g·mL-1)给药组细胞凋亡率分别为(37.48±1.76)％,(26.91±1.91)％,(25.61 ±2.05)％.同时,Westem blot结果说明泽泻萜类组分不同剂量给药组中Bcl-2和Bcl-xl蛋白水平都有显著地降低,而caspase-3蛋白水平显著地提高.q-PCR结果与Western blot结果一致,泽泻萜类组分不同剂量给药组中Bcl-2和Bcl-xl的mRNA水平都有显著的降低,而caspase-3 mRNA水平有显著的提高.Western blot和q-PCR结果说明,泽泻萜类组分不同剂量给药组中细胞的clustrein,Kim-1和TFF-3蛋白表达和mRNA水平均有显著地提高.HK-2细胞系体外评价结果表明,泽泻萜类组分具有肾毒性作用,但是还需要进一步的研究证明,同时可诱导HK-2细胞凋亡,为泽泻肾毒性研究以及临床用药安全提供依据.

本研究采用荧光探针FDA标记HK-2细胞,创建了一种快速筛查肾毒性物质方法.方法学考察结果表明,所建的肾毒性体外评价模型线性度、稳定性和准确性均满足应用要求.将其用于《中国药典》收载的32种有毒中药的352个组分进行规模化普筛,发现巴豆等14种中药材的31个组分对HK-2细胞具有明显毒性,可能会引起肾毒性.其他18种中药的各组分对HK-2细胞未见明显毒性.

目的 观察EGFR信号通路对高糖诱导下人肾小管上皮细胞(HK-2)凋亡的影响和机制.方法 体外培养HK-2细胞,将细胞分为4组:对照组、渗透压对照组、高糖组和高糖加EGFR抑制剂AG1478组.用Western blot检测p-EGFR、total EGFR、cleaved caspase-3、BAX、BCL-2及β-actin的蛋白表达,四唑盐比色法(MTT)检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡.结果 与对照组和渗透压对照组相比,高糖组HK-2细胞EGFR活性、cleaved caspase-3表达、BAX/BCL-2比值和内质网应激(ERS)明显升高,细胞活性降低(P＜0.01).EGFR抑制剂AG1478能够明显抑制高糖诱导的HK-2细胞EGFR活化和细胞凋亡(P＜0.05),提高细胞活性(P＜0.05),同时抑制内质网应激(P＜0.05).结论 抑制EGFR活性能够减少高糖诱导的HK-2细胞凋亡,这可能是通过减少内质网应激实现的.

目的 观察血红素对人肾小管上皮细胞HK-2的损伤作用.方法 体外培养人肾小管上皮HK-2细胞,经50、100、150、200μmol/L血红素处理3、6、12 h后,MTT法检测细胞活性,光镜、电镜观察细胞病理形态改变.结果 与对照组比较,50μmol/L血红素组细胞活性未见明显变化,100、150、200μmol/L血红素明显降低HK-2细胞活性；光镜下可见细胞皱缩、变圆；超微结构改变主要为微绒毛数量减少、内质网扩张和空化等.结论 一定浓度的血红素降低HK-2细胞活性,引起其形态学改变.

目的研究硫化氢（ H2 S）对七叶皂苷钠（ SA）细胞毒性的保护作用。方法培养HK-2细胞分别建立H2 S处理[培养基中添加H2 S的供体硫氢化钠（ NaHS ）]和 H2 S 关键合成酶胱硫醚β合成酶（ CBS）、胱硫醚γ裂解酶（ CSE）的抑制剂炔丙基甘氨酸（ PPG）处理的实验模型。 CCK-8实验检测细胞存活率；流式细胞凋亡实验检测细胞凋亡率。结果 SA 处理 HK-2细胞24 h 后，细胞存活率为（48.21±3.57）％，细胞凋亡率为（40.8±1.41）％。同时给予SA和NaHS处理，HK-2细胞存活率[（74.35±3.62）％]升高，凋亡率[（17.7±0.55）％]降低（ P＜0.01）；相反，同时给予SA和PPG处理，对HK-2细胞的毒性作用增强，细胞存活率[（19.67±2.31）％]降低，细胞凋亡率[（76.91±2.36）％]升高（P＜0.01）。结论 H2S能对抗SA对HK-2细胞的毒性作用，抑制细胞凋亡。

目的 探讨p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路对高糖环境下HK-2细胞凋亡的影响.方法 用p38 MAPK信号通路抑制剂作用于高糖环境下的HK-2细胞,MTT检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法检测细胞活性氧簇(ROS)水平,Western blot检测p38MAPK、磷酸化的p38 MAPK(p-p38 MAPK)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved caspase-3)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)蛋白水平,ELISA检测上清中肿瘤坏死因子 α(TNF-α)水平.结果 高糖作用后的HK-2细胞活力降低[(0.79±0.05)vs(0.32±0.02]),细胞凋亡率[(5.35±0.58)％vs(17.42±1.23)％]、细胞中ROS水平[(4.62±0.05)vs(20.65±0.21)]、细胞培养液上清中TNF-α 水平[(25.64±1.36)vs(50.71±1.28)mg/L]均升高,cleaved caspase-3、caspase-3、p-p38 MAPK蛋白水平升高,与对照组HK-2细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05).在细胞培养液中加入p38 MAPK信号通路抑制剂培养后,细胞凋亡率降低[(17.42±1.23)％vs(12.65±1.14)％vs(9.17±0.85)％vs(7.25±0.64)％],细胞活力升高[(0.32±0.02)vs(0.41±0.03)vs(0.52±0.04)vs(0.68±0.05)],细胞中ROS水平[(20.65±0.21)vs(16.21±1.23)vs(12.04±1.36)vs(9.75±0.09)]和细胞培养液上清中TNF-α 水平[(50.71±1.28)vs(43.23±2.24)vs(36.01±2.17)vs(32.84±1.22)mg/L]均降低,细胞中cleaved caspase-3、caspase-3、p-p38 MAPK的蛋白水平降低,且p38 MAPK信号通路抑制剂浓度越高,作用越显著,与单纯高糖培养后的细胞比较,差异有统计学意义(P<0.05).结论 抑制p38 MAPK信号通路可减弱高糖诱导的HK-2细胞凋亡.

目的 研究凋亡诱导因子(AIF)在顺铂诱导肾小管上皮细胞HK-2凋亡中的作用.方法 采用Western blot法和荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)分别检测不同浓度(0、25、50、100、150、200 μmol/L)和不同时间(0、3、6、9、12 h)顺铂作用下,体外培养HK-2细胞中AIF蛋白和mRNA表达.采用免疫荧光染色检测顺铂作用下HK-2细胞AIF表达分布.采用原位末端标记(TUNEL)法和流式细胞仪检测泛caspase抑制剂和AIF靶向siRNA对顺铂作用下HK-2细胞凋亡的抑制作用.结果 经不同浓度和不同时间顺铂的作用,HK-2细胞胞质AIF(cAIF)、胞核AIF(nAIF)及其mRNA表达均有不同程度增加.从25 μmol/L顺铂作用12 h和50 μmol/L顺铂作用3 h起,cAlF表达均有升高,分别是对照组的2.3倍(P<0.05)和1.7倍(P<0.01).nAIF表达呈一定浓度和时间依赖性,在150 μmol/L顺铂作用12 h和50 μmol/L顺铂作用9 h达到高峰,分别为25 μmol/L组的4.3倍(P<0.005)和3 h组的3.7倍(P<0.05),nAIF表达与多聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶1(PARP-1)剪切片段(cl-PARP)的表达趋势基本一致.AIF mRNA表达在50 μmol/L顺铂作用0-9 h区间呈梯度增加.免疫荧光染色结果显示,经顺铂作用后,部分HK-2细胞发生AIF核转位.泛caspnse抑制剂Z-VAD-FMK和AIF siRNA对顺铂诱导细胞凋亡的抑制率分别为60.1%和39.2%,两者联合应用的抑制作用更加明显.结论 AIF蛋白激活和核转位以及AIF mRNA表达的增加介导了顺铂诱导的肾小管上皮细胞的凋亡,可能为防治顺铂诱导的肾毒性作用提供了新靶点.

目的 探索糖原合成激酶-3β(GSK-3β)/β-连环蛋白信号通路对贫铀(depleted uranium,DU)致人肾近曲小管上皮HK-2细胞损伤的作用.方法 不同浓度DU染毒HK-2细胞3 ～24 h,采用免疫荧光法检测肾损伤分子-1(KIM-1)和中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)表达水平以观察DU诱导HK-2细胞的损伤,免疫荧光法检测β-连环蛋白核转位,Western blot法检测p-GSK-3β(S9)、GSK-3β、β-连环蛋白及c-myc蛋白表达变化,观察GSK-3β/β-连环蛋白信号通路的时相变化;采用GSK-3β(KD)质粒瞬时转染和GSK-3β特异性抑制剂TDZD-8处理抑制HK-2细胞的GSK-3β活性,采用β-连环蛋白质粒瞬时转染HK-2细胞使其过表达,观察GSK-3β活性和β-连环蛋白表达变化对DU染毒致HK-2细胞损伤的影响.结果 300和600μmol/L DU染毒致HK-2细胞KIM-1和NGAL阳性细胞率随染毒时间的延长和染毒剂量的增加而增加,染毒后6、9和24 h明显高于空白对照组(KIM-1阳性细胞率:t=11.06、18.97、30.49,P＜0.05;t=6.79、16.02、85.45,P＜0.05;NGAL阳性细胞率:t=11.78、11.37、34.29,P＜0.05;=7.34、21.63、36.84,P＜0.05);p-GSK-3β(S9)/GSK-3β比值和核β-连环蛋白阳性细胞率于染毒后3、6、9和24 h明显高于空白对照组[p-GSK-3β(S9)/GSK-3β比值:t=3.95、4.69、5.40、3.34,P＜0.05];核β-连环蛋白阳性细胞率:t=4.61、6.52、36.64、14.93,P＜0.05),于染毒后9h达峰值,还激活了β-连环蛋白下游靶基因c-myc的蛋白表达.瞬时转染GSK-3β(KD)质粒明显抑制了HK-2细胞的GSK-3β活性(t=8.07,P＜0.05),降低了DU致染毒HK-2细胞的KIM-1阳性细胞率(t=24.77,P＜0.05).TDZD-8抑制GSK-3β活性的同时提高了β-连环蛋白核转位,亦能显著降低DU染毒诱导HK-2细胞的KIM-1阳性细胞率(=6.25、6.73,P＜0.05).而且,β-连环蛋白过表达显著减轻了DU诱导的HK-2细胞损伤(t=7.48,P＜0.05).结论 GSK-3β/β-连环蛋白信号通路是调控DU致HK-2细胞毒性的关键通路,抑制GSK-3β活性及β-连环蛋白表达能有效拮抗DU诱导的HK-2细胞损伤.

从动物和细胞水平观察螯合剂N,N'-1,2-亚乙基双[N-(2,3-二羟基苯甲基)]甘氨酸(BPCBG)对铀的促排效果,以及对铀致人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)损伤的保护作用.大鼠腹腔注射(ip)醋酸铀酰后立即肌内注射(im)不同剂量的BPCBG,采用ICP-MS方法测定24 h的尿铀排出量和肾、骨中铀蓄积量.人肾近曲小管上皮HK-2细胞染铀24 h后给予不同剂量的BPCBG作用24 h,采用ICP-MS方法检测细胞内铀含量.不同剂量醋酸铀酰染毒HK-2细胞后立即或延迟24 h给予BPCBG作用24或48 h,采用CCK-8试剂盒检测细胞存活率,采用CB微核法观察BPCBG对铀致染色体损伤的影响,采用DCFH-DA荧光探针法检测BPCBG对铀诱导细胞内氧自由基生成的影响.以上实验均以DTPA-CaNa3作对照.结果表明,BPCBG (60、120和600 μmol·kg-1)使24 h尿铀排出量较铀中毒对照组明显增加约37％～61％,肾、骨中铀蓄积量降低至中毒对照组的41％～31％和86％～42％,促排效果随给药剂量增加而明显增强.HK-2细胞铀染毒后延迟24 h给予10～250 μmol·L-1 BPCBG作用24 h,使细胞内铀含量较铀染毒组显著降低约55％～60％,并能明显提高铀染毒HK-2细胞的存活率,显著降低铀诱导的微核形成,有效抑制铀诱导的细胞内氧自由基的产生.DTPA-CaNa3虽能明显降低大鼠肾铀蓄积量和细胞内铀含量,但促排效果显著低于BPCBG,且对铀致细胞损伤无保护作用.以上动物和细胞实验均证明BPCBG是有效的铀促排剂,明显优于DTPA-CaNa3,并具有清除铀诱导细胞内氧自由基产生的作用,可以保护铀致肾细胞损伤,值得进一步研究.

目的:研究傣药倒心盾翅藤对肾结石模型大鼠及草酸钠损伤肾小管上皮细胞(HK-2)的影响.方法:用乙二醇和氯化铵诱导大鼠肾草酸钙结石模型,分组灌胃给予水和95％醇提取液,4周后测定血清中肌酐(creatinine,Cr)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、钙(Ca2+)、磷(P)含量和肾组织钙(Ca2+)、镁(Mg2+)含量,镜下观察肾组织病理改变并对肾脏结晶沉积情况进行统计分析;采用MTT法测定不同极性部位提取液对草酸钠致肾小管上皮细胞(HK-2)损伤的保护作用.结果:倒心盾翅藤水和95％醇提液高剂量组能明显降低大鼠血清Cr,BUN,肾Ca2+含量及肾组织草酸钙结晶沉积(P＜0.05),并能显著提高草酸钠诱导建立的肾小管上皮模型细胞的细胞活力,其中,95％醇提液的乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水提水部位能显著提高模型细胞的细胞活力.结论:傣药倒心盾翅藤具有显著的抗肾结石活性,乙酸乙酯部位、正丁醇部位以及水部位可能是其抗结石活性的有效部位.

目的:评价富马酸泰诺福韦双特戊酯的线粒体毒性,为临床试验剂量设计和合理用药提供参考.方法:测定HepG2和HK-2细胞增殖抑制率,培养液上清乳酸含量,线粒体呼吸链复合体活性,mtDNA含量和线粒体结构变化,用已上市阳性药物验证,综合评价受试物线粒体毒性.结果:与对照组比,高剂量组对两种细胞均具有明显线粒体毒性,中剂量组毒性较弱,低剂量组无明显毒性.结论:富马酸泰诺福韦双特戊酯25μg· mL-1对机体肝组织的潜在线粒体毒性较弱；富马酸泰诺福韦双特戊酯40 μg· mL-1对机体肾组织的潜在线粒体毒性较弱.

目的:研究威替米星和庆大霉素对体外培养的人肾小管上皮细胞系(HK-2)毒性作用的分子机制.方法:利用基因芯片技术检测3.2 mg·mL-1威替米星和庆大霉素作用于HK-2细胞48 h后基因表达的变化.结果:威替米星诱导HK-2细胞87个基因发生显著的上调,10个基因发生明显的下调.庆大霉素则引起62个基因表达显著上调,18个基因明显下调.差异表达的基因的功能涉及细胞生长增殖调控、凋亡、细胞周期、应激反应、转运及代谢酶等方面.结论:威替米星和庆大霉素改变细胞凋亡、应激反应及转运等相关基因表达可能参与其细胞毒性作用过程.

目的 研究七叶皂苷不同组分和七叶皂苷钠注射剂提取物(ESA)的肾毒性及可能的作用机制.方法 以成人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)为模型,氯化汞(HgCl2)为阳性对照,研究含七叶皂苷Ia(A)与Ib(B)的提取物(A+B)、含异七叶皂苷Ia(C)与Ib(D)提取物(C+D)、含A+B+C+D及ESA的细胞毒性以及抗氧化剂维生素C(Vit C)和还原型谷胱甘肽(GSH)对ESA毒性的拮抗作用.用MTT法检测细胞存活率;乳酸脱氢酶(LDH)释放实验检测细胞膜损伤;倒置显微镜观察细胞形态学改变;流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡.结果 A+B,C+D、A+B+C+D和ESA分别与HK-2细胞作用24 h, 均显著抑制细胞的存活,并且具有良好的浓度-效应关系,半数抑制浓度(IC50)值分别为: (26.5±1.7),(35.4±2.2),(28.4±1.8)和(23.3±1.7)μmol·L-1.A+B,A+B+C+D (60~100 μmol·L-1), C+D和ESA(40~100 μmol·L-1)分别与HK-2细胞作用24 h, LDH释放率明显升高.80 μmol·L-1 A+B,C+D,A+B+C+D和ESA分别与HK-2细胞作用24 h,相差显微镜下可观察到细胞收缩、变圆.ESA和A+B+C+D均能导致HK-2细胞出现明显的G2/M期阻滞,同时伴有S期细胞减少,并且随着浓度的增加,G2/M期细胞所占的比例逐渐增加.抗氧化剂Vit C不能拮抗HgCl2和ESA引起的细胞损伤作用;GSH对HgCl2 30 μmol·L-1引起的细胞损伤有一定的拮抗作用,GSH对ESA 30及60 μmol·L-1引起的细胞损伤均有一定的拮抗作用,但对ESA 100 μmol·L-1引起的细胞损伤无拮抗作用.结论 七叶皂苷对肾小管上皮细胞具有明显的毒性, 七叶皂苷不同组分之间的毒性存在显著差异.氧化损伤可能是其毒性机制之一.

目的 探讨亚硫酸氢钠穿心莲内酯(ASB)对人肾小管上皮细胞HK-2的细胞毒性作用.方法 HK-2细胞在DMEM/F12培养液培养24 h后,在经ASB作用2h前,分别加入N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)10 mmol· L-1、2-氨基-4(丁基磺酸亚氨)-丁酸(BSO)2 mmol· L-1及30 min前分别加入过氧化氢酶(CAT)1000 U· L-1、环孢素A (CsA)50 μmol·L-1,再经ASB作用24 h,MTT法检测细胞存活率;用酶标仪检测乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、总ATP酶(T-ATP)活性;流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡、线粒体膜电位(MMP)和活性氧(ROS);Western蛋白质印迹法检测胱天蛋白酶酶原3、Bcl-2、Bax和细胞色素c(Cyt c)蛋白的表达.结果 ASB呈浓度依赖性地抑制HK-2细胞增殖,作用24和48 h后IC5o值分别为19.1±3.6和(11.6±3.9)g·L-1.ASB 20 9·L-1处理HK-2细胞24 h后,G2/M期细胞由对照组的(23.3±1.0)％增至(37.0±0.8)％(P＜0.01).与正常对照组相比,ASB组LDH漏出率和ROS水平明显增加,MMP呈下降趋势;与ASB 20 9·L-1组相比,加入还原剂NAC后,细胞存活率和MMP水平明显增加(P＜0.05),LDH和ROS水平明显降低(P＜0.05);加入CsA后,细胞存活率显著降低(P＜0.01),LDH和细胞内ROS水平明显增加(P＜0.05).随着ASB浓度增加,HK-2细胞上清液中的MDA水平明显增加,GSH,SOD和T-ATP酶活性逐渐减弱;同时细胞内胱天蛋白酶原3、Bax和Cyt c蛋白表达升高.结论 ASB对HK-2细胞的毒性作用可能是通过干扰HK-2细胞线粒体能量代谢,改变细胞内氧化还原状态,耗竭细胞内GSH和SOD,导致细胞内ROS大量堆积,引发脂质过氧化作用,破坏细胞膜的通透性,导致Cyt c等凋亡因子从线粒体释放,进而引发细胞凋亡或坏死.

目的：观察和比较穿心莲内酯及其水溶性衍生物〔亚硫酸氢钠穿心莲内酯（ASB）、穿琥宁和炎琥宁〕的原料药对人肾小管上皮细胞HK-2的毒性作用，探讨ASB所致内质网应激作用机制。方法 MTT法检测分别给予4种药物作用后HK-2细胞存活率，计算半数抑制浓度（IC50）。ASB给药组采用Hoechst33342染色和流式细胞术检测细胞凋亡；检测细胞内超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量；Western蛋白质印迹法检测免疫球蛋白重链结合蛋白（Bip）、增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）和胱天蛋白酶4的表达。结果4种药物在一定浓度下均能抑制HK-2细胞增殖，呈时间和浓度依赖性。药物作用24 h，穿心莲内酯IC50为30.6μmol·L-1，均比其他衍生物小，而穿琥宁和炎琥宁的IC50（分别为16.2和15.6 mmol·L-1）相差不大，ASB的IC50为29.4 mmol·L-1。在ASB（0，15，30和60 mmol·L-1）处理24 h后，细胞凋亡率上升，SOD活性下降，MDA含量上升，均呈现浓度依赖性。与对照组比较，8 h时，ASB（30和60 mmol·L-1）组CHOP表达水平增加（P<0.01），Bip和胱天蛋白酶4蛋白无显著变化。另外，24 h时，ASB（60 mmol·L-1）组Bip蛋白水平减少（P<0.05），ASB（30和60 mmol·L-1）组CHOP蛋白表达增加（P<0.01）；活化的胱天蛋白酶4随ASB浓度升高表达增加（P<0.01）。结论穿心莲内酯及其水溶性衍生物对HK-2细胞具有一定毒性作用，内质网应激相关的CHOP和胱天蛋白酶4通路参与了ASB诱导的细胞凋亡。

目的 研究葛根素注射液对人近曲小管上皮细胞HK-2细胞株增殖的影响,以及对高糖诱导后细胞内78KD-糖调节蛋白(GRP78)表达的影响.方法 设置葛根素质量浓度梯度,依次为5、10、20、40、80、160、320、640 g/L,采用MTT方法,检测HK-2细胞的增殖情况.HK-2细胞传代贴壁后,无血清培养24 h后,分为正常组、模型组和葛根素治疗组,继续培养48 h后,提取各组细胞总RNA,采用Real Time PCR的方法,检测GRP78 mRNA的表达情况.结果 随着浓度的增大,葛根素注射液对HK-2细胞增殖的抑制作用增强.经葛根素注射液作用48 h后,与正常组相比,模型组GRP78 mRNA的表达量增多,差异有显著性(P＜0.01);与模型组比较,治疗组GRP78 mRNA的表达量增加,差异有显著性(P＜0.01).结论 葛根素注射液对HK-2细胞增殖具有抑制作用;高糖刺激HK-2细胞48 h后,可导致其发生内质网应激反应,葛根素注射液可通过增加内质网伴侣蛋白GRP78的表达量,以促进蛋白质正确折叠,来恢复细胞的稳态.

目的 观察疏利少阳法代表方肾疏宁对乙型肝炎病毒(HBV)诱导人肾皮质近曲小管上皮细胞(HK-2)细胞转分化pSmad3蛋白表达的影响,以探讨该方治疗乙型肝炎病毒相关性肾炎(HBV-GN)的相关机制.方法 应用MTT法确定肾疏宁的体外给药浓度,设9组浓度梯度,在酶标仪OD570 nm处测量各孔的吸光值,并计算细胞存活率,根据绘制的生长曲线,计算半数抑制率(IC50),IC50对应的浓度即为下一步实验给药的浓度.分别用C基因型重组乙型肝炎病毒质粒pHY106-HBV及重组人生长转化因子-β1(TGF-β1)刺激剂干预HK-2细胞,实验分为6组:空白对照组(HK-2细胞常规培养),空质粒组(转染空质粒pHY106的HK-2细胞),HBV组(转染pHY106-HBV的HK-2细胞),TGF-β1组(HK-2细胞中加入12 ng重组人TGF-β1),HBV+肾疏宁组(HK-2细胞在转染pHY106-HBV后6 h加入肾疏宁),TGF-β1+肾疏宁组(HK-2细胞在重组人TGF-β1刺激6 h后加入肾疏宁).药物干预48 h后,用Westernblot检测方法检测pSmad3的表达量.结果 根据细胞存活率绘制的细胞生长曲线,计算IC50值为生药浓度1.313 g/mL按1/200稀释的加药浓度.Westernblot法检测各组pSmad3蛋白的表达,HBV组与空质粒组比较pSmad3蛋白表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1组与空白对照组比较pSmad3蛋白表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);HBV+肾疏宁组与HBV组比较pSmad3蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1+肾疏宁组与TGF-β1组比较pSmad3蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05).结论 在生药浓度1.313 g/mL按1/200稀释的加药浓度下,肾疏宁能降低pSmad3蛋白表达,进而推测其可通过抑制Smad介导的信号转导通路而干预HK-2细胞转分化.

目的 探讨高浓度葡萄糖对人肾脏近曲小管上皮(HK-2)细胞的糖毒性及α-亚麻酸/亚油酸(ALA/LA)的改善作用.方法 常规方法 培养接种HK-2细胞,设置11个葡萄糖浓度,MTT法检测葡萄糖的糖毒性;设立正常对照组、高糖模型组、阳性对照组、ALA组、LA组和ALA/LA组,检测a-ALA/LA的干预作用;葡萄糖氧化酶-过氧化物酶(GOD-POD)法检测HK-2细胞的葡萄糖吸收.结果 高浓度葡萄糖(≥25.3 mmol/L,培养48h)显著抑制HK-2细胞的存活率(P<0.05);培养48 h,葡萄糖浓度25.3~56.5 mmol/L可作为HK-2细胞葡萄糖毒性造模条件;适宜剂量的ALA、LA及适宜比例的ALA/LA,能够降低HK-2细胞的葡萄糖毒性,增加HK-2细胞的葡萄糖吸收.结论 必需脂肪酸ALA/LA能降低葡萄糖对HK-2细胞的糖毒性,增加其葡萄糖吸收功能.

目的 探讨乌司他丁(ulinastatin,UTI)上调P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)表达对百草枯(paraquat,PQ)诱导HK-2细胞损伤的保护作用及机制.方法 实验分为两部分.第一部分实验分为正常对照组、PQ组、UTI+PQ组、UTI对照组.第二部分实验分为阴性病毒组(包含对照组、PQ组、PQ+UTI组、UTI组)和P-gp siRNA组(包含对照组、PQ组、PQ+UTI组、UTI组).阴性病毒组:细胞转染空白病毒;P-gp siRNA组:细胞转染携带P-gp siRNA的病毒.常规培养HK-2细胞,在800 μmol/LPQ干预后,蛋白免疫印迹法(Westem blot)检测HK-2细胞内P-gp表达量.并以携带P-gp沉默基因的慢病毒技术抑制P-gp表达,应用细胞活性检测试剂盒(Cell Counting Kit-8,CCK-8)法检测细胞存活率;Western blot法检测病毒转染后的P-gp的表达量;高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测细胞内PQ浓度.结果 与正常对照组比较,PQ组细胞内P-gp的表达量无明显变化;与PQ组比较,UTI+PQ组细胞内P-gp的表达量明显升高,差异有统计学意义(P＜0.05).与相应阴性病毒组比较,P-gp siRNA组细胞存活率无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05).与阴性病毒+PQ组比较,P-gp siRNA+PQ组细胞内PQ浓度无明显变化,差异无统计学意义(P＞0.05);与P-gp siRNA+PQ组比较,P-gp siRNA+PQ+UTI组细胞内PQ含量明显降低,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 UTI在体外能明显减少PQ诱导的HK-2细胞损伤,提高HK-2细胞的存活率,但可能与其上调P-gp的表达关系不大.

[目的]观察糖肾1号方含药血清干预高糖环境下培养的人肾小管上皮细胞(HK-2)中转化生长因子-β1 (TGF-β1)、α-平滑肌蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(FN)mRNA和蛋白水平,初步探索糖肾1号方治疗糖尿病肾病可能的作用机制.[方法]选用HK-2细胞,分为空白组、高糖组、空白血清组、糖肾1号方含药血清低剂量组、糖肾1号方含药血清高剂量组.高糖环境下培养24 h后,进行血清干预24 h,培养48 h后收集细胞,通过逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测HK-2细胞中TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平.[结果] 1)与空白组相比,高糖组的TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和蛋白表达水平明显增多,差异具有统计学意义(P＜0.05).2)与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组、糖肾1号方高剂量组TGF-β1、α-SMA、FN mRNA表达水平减少,差异具有统计学意义(P＜0.05).3)与高糖组相比,糖肾1号方低剂量组FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义(P＜0.05),糖肾1号方高剂量组α-SMA、FN蛋白表达水平减少,差异具有统计学意义(P＜0.05).4)与糖肾1号方低剂量组相比,糖肾1号方高剂量组TGF-β1、FN mRNA降低,差异具有统计学意义(P＜0.05).[结论]糖肾1号方含药血清可抑制TGF-β1、α-SMA、FN mRNA和α-SMA、FN蛋白表达水平,糖肾1号方高剂量组效果优于糖肾1号方低剂量组.