目的评价菌落PCR法鉴定噬菌体抗体库阳性重组率的可靠性. 方法鼠抗体基因Lc片段、Fd片段经酶切、纯化后,依次克隆入pComb3载体上相应的酶切位点,电转化XL1-blue菌后建立鼠源性Fab噬菌体抗体库.比较菌落PCR法、质粒PCR法及质粒酶切法鉴定转化菌阳性重组率的一致性.同时用空菌、空载体、空载体菌等作模板为对照PCR,以排除相关组分的干扰. 结果建立的Lc库的库容为1.175×106CFU, Fab库的库容为1.02×106CFU.3种方法鉴定的阳性重组率不同(Lc的重组率依次为100%、78%、78%,Fd的重组率依次为90%、66%、66%,Lc与Fd同时插入的重组率依次为90%、50%、50%).菌落PCR法鉴定的重组率偏高,存在假阳性现象.对照PCR提示,XL1-blue菌本身可能是导致假阳性扩增的原因. 结论用菌落PCR法不能准确鉴定噬菌体抗体库的重组率,用质粒PCR法或质粒酶切法鉴定更为可靠.
目的为建立简便、可靠转化菌的筛选方法.方法应用菌落PCR和重组质粒PCR方法对转化菌进行筛选和DNA序列分析.克隆载体和表达载体筛选及鉴定采用与载体多克隆插入位点序列互补的通用引物或免疫球蛋白家族特异性引物.阳性菌落和质粒PCR产物通过酶消化后作为模板进行自动测序.结果菌落PCR和质粒PCR技术可作为基因克隆筛选和鉴定的方法.结论菌落PCR和质粒PCR方法简便、快速、可靠,其产物可作为模板直接用于序列分析.
