背景与目的：微小RNA(microRNA，miRNA)是一类小分子内源性RNA，主要在转录后水平调节靶基因的表达。microRNA-335(miR-335)作为一种肿瘤抑制因子，参与了多种人类肿瘤的发生、发展过程。本研究旨在探讨miR-335是否靶向抑制Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK1)基因的表达，并以此调控人骨肉瘤细胞MG-63侵袭及转移。方法：理论预测并通过荧光素酶基因报告验证miR-335与ROCK1基因的3'-非翻译区(untranslated region，UTR)的特异性结合作用；real-time PCR和蛋白质印迹法(Western blot)分别从基因和蛋白水平检测miR-335对ROCK1表达的负性调控作用；Transwell小室法检测miR-335过表达及下调ROCK1表达后MG-63侵袭及转移能力的变化。结果：Targetscan预测显示，miR-335与ROCK13'-UTR存在结合位点。荧光素酶基因报告实验结果显示，miR-335 mimic和ROCK13'-UTR能够靶向结合；miR-335在MG-63细胞中低表达，ROCK1则呈高表达。Western blot检测结果显示，转染miR-335 mimic或转染ROCK1 siRNA后ROCK1的蛋白表达减少。Transwell小室法检测结果显示，过表达miR-335或下调ROCK1后穿过基膜的细胞数目明显下降。结论：miR-335能特异性结合于ROCK1基因的3'-UTR并下调ROCK1的表达，抑制人骨肉瘤细胞MG-63侵袭转移。
目的 观察微小RNA (miR)-335靶向Sp1对乳腺癌细胞株MCF-7增殖的影响.方法 选取MCF-7为研究对象,采用荧光素酶报告基因实验验证miR-335对Sp1的靶向作用;采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中miR-335及Sp1 mRNA表达;采用Western blot检测细胞中Sp1蛋白表达;采用噻唑蓝(MTT)法检测MCF-7增殖水平.结果 与正常乳腺上皮细胞株HBL-100比较,MCF-7中miR-335表达显著降低(0.93 ±0.11比2.94±0.13),Sp1蛋白表达显著增加(0.89±0.08比0.42±0.05,P＜0.01).miR-335可与Sp1基因3'-非翻译区(UTR)特异性结合.转染miR-335 mimic可使MCF-7中miR-335表达显著提高,Sp1蛋白表达显著降低,细胞增殖受到抑制;转染miR-335 mimic+ Sp1可使Sp1蛋白表达显著提高,同时部分逆转miR-335对MCF-7细胞增殖的抑制作用.结论 miR-335可通过靶向Sp1抑制乳腺癌细胞株MCF-7增殖.
目的 观察微小RNA(miRNA,miR)-335靶向特异蛋白一员(Sp1)对前列腺癌细胞(LNCaP)增殖的调控.方法 选取LNCaP为研究对象,采用荧光素酶活性实验验证miR-335对Sp1的靶向作用;采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测细胞中miR-335表达;采用Western blot检测细胞中Sp1蛋白表达;采用噻唑蓝(MTT)法检测LNCaP细胞增殖活性.结果 与前列腺增生上皮细胞BPH-1比较,LNCaP中miR-335表达(0.83±0.22)显著低于BPH-1 (2.97±0.51);LNCaP中Sp1蛋白表达(0.92±0.18)显著高于BPH-1 (0.31 ±0.07).miR-335可与Sp1 3'-非编码区(UTR)特异性结合,降低荧光值.转染miR-335可使LNCaP中miR-335高表达,降低Sp1蛋白表达,并抑制LNCaP细胞增殖活性.同时转染miR-335及Sp1表达质粒可增加LNCaP中Sp1蛋白表达,并部分逆转miR-335对LNCaP细胞增殖的抑制作用.结论 miR-335可通过靶向Sp1抑制前列腺癌细胞LNCaP增殖.
目的 观察微小RNA(miR)-335在乳腺癌细胞侵袭中的作用.方法 分别在Basallike类型正永用生化细胞MCF10A和Luminal A乳腺癌细胞MCF7中抑制和过表达miR-335的含量,采用Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力的改变;利用生物信息学网站预测miR-335靶基因,并用荧光报告基因检测实验验证;应用miR-335抑制剂及靶基因siRNA单转染和共转染,验证miR-335是否通过靶基因执行功能.最后利用实时荧光定量聚合酶链反应检测在35例原发性乳腺癌组织中miR-335的表达水平.结果 在MCF10A内敲减miR-335,细胞发生侵袭的数目由对照组51个增加到实验组的67个,促进细胞侵袭的能力(P＜0.05).在MCF7中过表达miR-335后,由对照组侵袭数目51个降至实验组43个,抑制细胞侵袭的能力(P＜0.05).miR-335能够靶向结合人类表皮生长因子3(ERBB3)的mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR),抑制ERBB3 mRNA及蛋白水平表达(P＜0.05).敲减ERBB3后能够恢复miR-335低表达造成的细胞侵袭能力的降低(P＜0.05).miR-335在原发性乳腺癌组织中表达为正常组织的0.75,呈显著低表达(P＜0.01).结论 在原发性乳腺癌组织样本中,miR-335低表达,并且通过靶向ERBB3影响细胞的侵袭能力.
目的 检测微小RNA-335 在急性缺血性脑卒中( AIS)患者血清中的表达,并探讨其对钙调蛋白(CaM)调控的作用机制. 方法 采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法测定106例AIS患者及98例健康对照组血清中miR-335表达情况;用生物信息学数据库查询分析miR-335对钙调蛋白编码基因CALM1的靶向结合关系;脂质体转染法将miR-335模拟物、抑制物以及相应阴性对照物分别转染至人脐静脉内皮细胞( HUVECs)中并进行细胞培养,采用逆转录PCR( RT-PCR)和Western blot分别检测干预后HUVECs中钙调蛋白mRNA和蛋白的表达水平. 结果 与健康对照组相比较,AIS组患者血清miR-335表达明显下调(P＜0. 01);生物信息学软件的查询分析显示CALM1存在miR-335潜在靶向结合位点;RT-PCR和Western blot检测结果显示miR-335模拟物组CaM mRNA和蛋白的表达水平较对照组显著下降(P＜0. 01),而miR-335抑制物组CaM mRNA和蛋白的表达水平较对照组显著增高(均P＜0. 05). 结论 急性缺血性脑卒中患者血清miR-335表达明显下降,表达下调的miR-335可能通过上调钙调蛋白的表达从而发挥重要作用.
