主要根据作者的经验,对RAPD实验技术中的扩增仪及扩增程度、DNA模板浓度及纯度、引物的种类与浓度、Taq酶、缓冲系统、Mg2+、dNTP的浓度、设立空白对照、扩增产物鉴定、条带统计和同源性认定、RAPD反应程序标准化等问题进行了论述,其中降解了的DNA模板在不同的浓度时会产生不同的扩增式样,国产Taq酶的不同批次间会产生较大的扩增差异为首次报道,并提供了获得清晰条带的电泳策略.概述了RAPD的主要特点和适用范围.

ABI 377 DNA测序仪是由美国应用生物系统公司(ABI)生产的全自动测序仪.它采用平板式凝胶测序系统,操作方便灵活.因此,在参与人类基因组计划的测序仪中,ABI377占了绝大多数.测序仪分析的DNA样品--模板必须先经测序反应,即根据Sanger的末端终止法原理,通过PCR以模板的碱基序列对应地将用4色荧光标记的4种双脱氧核糖核酸(ddNTP)精确无误地接上,然后测序仪通过读取这4种ddNTP的荧光信号获得待测样品的序列.笔者在实际工作中发现,测序结果的好坏并不是由测序仪的检测或其凝胶分离系统即测序仪本身造成,而是由测序前所做的测序反应是否成功决定的.因此,本文就对测序反应影响最大的两个人为因素--模板和引物以及对它们的要求作一简要介绍.

目的体外构建合成针对Nucleostemin(核干细胞因子,NS)基因的短发夹状干扰RNA(shRNA),用于进一步研究以该基因为靶目标、RNA干扰(RNA interference,RNAi)为手段的白血病基因治疗可行性.方法从Nucleostemin基因的三个变异体cDNA共同序列中筛选出2个3'端为AA的21个碱基片段作为shRNA合成的对应序列,9个碱基的5'-UCUCUUGAA-3'作为Loop环.以23个碱基的5'-GGATCCTAATACGACTCACTATA-3'作为T7启动子(T7 Promoter)序列,构建shRNA的体外合成双链DNA模板,一条链5'端无AA,顺序为启动子、shRNA正义信息链、Loop环、shRNA反义信息链,共70个碱基;另一条是该链的互补链,5'端带有AA,共72个碱基.在T7 RNA聚合酶(T7 RNA polymerase)作用下合成shRNA,纯化后通过凝胶电泳比较灰度值确定shRNA浓度;shRNA作用于HL-60细胞,通过观察细胞形态变化和NS-mRNA抑制率验证干扰效果.结果体外合成的两条shRNA电泳无降解和弥散现象,浓度分别为5.24 μmol·L-1和3.35 μmol·L-1;干扰HL-60细胞48 h后,细胞密度和聚集程度下降,细胞之间大小相差悬殊,经shRNA-NS-2作用的HL-60细胞一部分由圆形变成了梭形并有明显的伪足;与对照组相比NS-mRNA抑制率分别达到37.82%和71.88%.结论体外成功构建和合成了两条针对Nucleostemin基因的shRNA,且抑制该基因表达的作用明显,shRNA-NS-2使HL-60细胞形态发生了改变.所合成的shRNA-NS-2可作为进一步研究该基因和探索白血病的基因治疗的工具.