在反义实验中成功的关键是选择合适的靶位点.但是,由于RNA折叠形成二级结构,会使大多数互补的核酸不能接近并形成分子间的碱基配对,因此这种选择非常困难.通常采用的方法,如"序列步移"或计算机辅助设计,并未获得显著的成功.为此,本文总结了几个经验选择方法,特别是基于转录物的RNase H图谱和寡核苷酸芯片扫描的方法.
建立依赖反义RNA和核糖核酸酶T1(RNase T1)的PCR方法,称为ART-PCR,用于扩增高拷贝RNA和复杂RNA样本中的低拷贝RNA.首先,设计待检低拷贝RNA的反义RNA分子,在高拷贝和复杂RNA样本中与待检低拷贝RNA退火后用RNase T1消化,反转录后用PCR扩增.进一步,用ARPE-19细胞中低表达基因干扰素γ(IFNG)作为实例,用ART-PCR和常规实时定量PCR(RT-qPCR)检测.结果显示,用ART-PCR可以很好地消除常规RT-qPCR中低拷贝RNA的PCR抑制效应.研究结果初步表明ART-PCR可以作为检测低拷贝RNA的理想工具,这对于RNA功能的基础研究以及基于多重PCR的临床复合病毒感染的基因诊断方法的优化、推广具有重要的参考价值.
