目的克隆人胃癌细胞端粒酶RNA组分(hTR)基因片段并构建其正义和反义真核表达载体,为以端粒酶为靶目标的肿瘤基因治疗奠定基础.方法采用RT-PCR方法从人胃癌细胞株MKN-45中扩增出人hTR部分cDNA序列.将该片段插入pEF6/V5-His-TOPO载体后构建人端粒酶RNA组分(hTR)基因正义真核表达载体(pEF-hTR).随后采用EcoRV和SpeⅠ从pEF-hTR上切下该目的基因片段并反向插入pBluescript Ⅱ KS载体上的EcoRV/SpeⅠ酶切位点上.最后采用KpnI和NotⅠ从pBluescript Ⅱ KS载体上切下该目的基因片段并正向插入pEF-hTR的KpnI/NotI酶切位点上从而构建出人端粒酶RNA组分(hTR)基因反义真核表达载体(pEF-ahFR).对所构建的载体均进行酶切鉴定和测序确认.结果所克隆的基因片段其碱基序列与文献报道完全一致,且插入载体的方向完全正确.结论本实验已成功克隆了人端粒酶RNA组分(hTR)基因的部分序列并成功构建其正义、反义真核表达载体,从而为研究反义抑制人胃癌细胞端粒酶活性对胃癌细胞生物学行为的影响奠定了基础.
目的:探讨人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)和Ki-67的表达与中晚期宫颈癌放射敏感性的关系.方法:应用免疫组化方法检测72例中晚期宫颈癌组织hTERT和Ki-67的表达情况.全部患者均采用单纯放射治疗,外照射用直线加速器6MV X线等中心盆腔野常规放疗DT＝40～44 Gy,腔内后装治疗(192Ir)每周1次6 Gy,A点参考剂量42 Gy.结果:hTERT和Ki-67的表达指数分别分布为56.4%～95.2%和4.8%～52.4%,平均值分别为75.8%和26.6%.hTERT和Ki-67的表达强度与放射敏感性相关,随着hTERT和Ki-67表达的增高,其放射敏感性有增高趋势.Logistic多因素回归分析,筛选出对放射敏感性有影响的因素依次为:hTERT、肿瘤的分化程度和肿瘤的体积.结论:hTERT和Ki-67表达与中晚期宫颈癌的放射敏感性呈正相关.
目的:探讨人脑胶质瘤恶性程度评定的客观标准.方法:采用组织微阵列技术,通过免疫组化的方法对60例不同级别人脑胶质瘤组织的hTERT和 Ki-67表达水平进行测定,并与10例正常组织比较.结果:Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤与对照组Ki-67表达阳性细胞标记指数分别为1.90±0.29、8.39±1.26、21.19±3.06与0.35±0.13,各组间差异有统计学意义,P＜0.001;hTERT表达阳性细胞标记指数分别为5.30±0.65、28.63±3.59、53.62±4.68与0,各组间差异有统计学,P＜0.01.hTERT与Ki-67表达阳性指数显著正相关,r=0.94,P＜0.01,hTERT表达水平越高,Ki-67的表达也越高.结论:联合测定Ki-67和hTERT表达水平可以作为评价胶质瘤生物学行为、判断临床预后的重要参考指标.
目的:探讨原核增强子能否提高hTERT启动子的转录活性及对其肿瘤特异性的影响.方法:将增强子SV40、CMV分别或组合构建一系列GFP和荧光素酶报告基因载体,转染人肝癌、鼻咽癌、宫颈癌、结直肠癌细胞、成纤维肉瘤和正常成纤维细胞,流式细胞仪计数和双荧光酶分析系统检测基因的表达效率.结果:在正常成纤维细胞中这些载体均不能有效表达;而在肿瘤细胞中hTERT启动子能介导基因表达但效率不高,增强子能使基因表达增强3～26倍,特别是单独CMV增强子和SV40-CMV双增强子使荧光素酶表达提高20～26倍,是常用的CMV增强子/启动子的2～7倍;完整CMV增强子/启动子对hTERT启动子的活性影响因不同细胞而异.结论:增强子能显著增强hTERT启动子的转录活性并对其肿瘤特异性没有影响,CMV增强子或SV40-CMV双增强子/hTERT启动子是高效特异的通用调控元件,用于靶向性肿瘤基因治疗具有巨大潜力.
目的:探讨在端粒酶(hTERT)启动子驱动下TRAIL基因在大肠癌细胞HT-29的表达及其杀细胞作用.方法:通过腺病毒载体系统将hTERT启动子驱动的TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)基因转入大肠癌细胞HT-29,流式细胞仪检测GFP/TRAIL的表达和HT-29细胞凋亡率.结果:端粒酶启动子驱动的GFP/TRAIL基因和CMV启动子驱动的GFP(绿色荧光蛋白)基因在HT-29内的表达率分别达31.4%和67.0%;GFP/TRAIL基因对HT-29细胞的生长抑制率和凋亡率分别达74.2%和25.8%,与PBS和Ad/CMV-GFP比差异都有显著性意义(P＜0.05).结论:端粒酶启动子驱动的GFP/TRAIL融合基因能在大肠癌细胞中有效表达;TRAIL基因对大肠癌细胞HT-29有明显的抑制生长和促凋亡作用.
目的构建并鉴定一种新型人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子驱动的条件复制型腺病毒载体.方法采用PCR的方法克隆腺病毒E1区基因(E1A, E1B55K)、E1B的启动子(E1Bp)以及人端粒酶逆转录酶亚基启动子(hTERTp),以及2个目的基因:人GM-CSF和GFP(Green Fluorescence Protein, GFP).采用一系列分子生物学方法构建pShuttle-GFPSV55K穿梭质粒,应用此穿梭质粒与AdEasy-1腺病毒DNA在BJ5183细菌内重组得到重组腺病毒质粒,将其转染293细胞获得Ad-GFPSV55K重组腺病毒.PCR法鉴定重组腺病毒,噬斑形成实验测病毒滴度.结果经过酶切鉴定成功地构建了分别携带GM-CSF基因和GFP报告基因的腺病毒载体,病毒滴度为7×1010 pfu/ml.结论成功获得由hTERT启动子驱动的条件复制型腺病毒载体,为肿瘤的基因治疗打下良好的基础.
目的探讨端粒酶蛋白催化亚单位(hTERT)基因mRNA及其蛋白在胃癌发生、发展中的重要作用以及在胃癌诊断中的意义.方法应用原位杂交方法检测53例胃癌标本中hTERTmRNA的表达,应用免疫组化S-P法检测相同标本中hTERT蛋白的表达.结果 53例胃癌标本中,hTERTmRNA阳性41例(77%),其中低分化腺癌阳性18例(82%),高分化腺癌阳性21例(81%),黏液腺癌及黏液细胞癌阳性2例(2/5);hTERT蛋白阳性共46例(87%),其中低分化腺癌阳性20例(91%),高分化腺癌阳性25例(96%),黏液腺癌及黏液细胞癌阳性1例(1/5);hTERTmRNA及hTERT蛋白的表达在低分化腺癌组与高分化腺癌组之间差异未见显著性(P>0.05),但hTERTmRNA与hTERT蛋白之间呈正相关(rS=0.623, P<0.01).结论 hTERTmRNA及蛋白表达的检测有可能为胃癌的诊断及鉴别诊断提供一种新的形态学的指标.
【目的】探讨人端粒酶启动子（hT ERT ）联合正常组织特异性miR‐34a （M IR）的整合靶向系统（hT ERT‐M IR）对胶质瘤细胞靶向性的影响。【方法】首先检测hT ERT、miR‐34a在人胶质瘤细胞株 U87、H4和人胶质细胞株HEB（正常细胞株）中的表达；通过质粒构建分别获得 hTERT‐Luc、hTERT‐MIR‐Luc、hTERT‐Bax 以及hTERT‐MIR‐Bax表达质粒，将hTERT‐Luc、hTERT‐MIR‐Luc质粒分别转染U87、H4和 HEB细胞中，检测三组细胞中hT ERT 与hT ERT‐M IR载体的表达活性；将hT ERT‐Bax以及hT ERT‐M IR‐Bax质粒分别转染U87、H4和HEB细胞中，比较三组细胞中hTERT‐Bax和hTERT‐MIR‐Bax对胶质瘤细胞增殖抑制能力的影响。【结果】hTERT在人胶质瘤细胞株U87和H4中特异性高表达，miR‐34a在人胶质细胞株HEB中特异性高表达；在正常胶质细胞株 HEB中，hTERT‐MIR的活性较 hTERT 明显减低（ P ＜0．01）；在胶质瘤细胞株 U87和 H4h中TERT‐Bax和hTERT‐MIR‐Bax 对细胞增殖抑制比较差异无显著性，但在正常胶质细胞株 HEB中，hTERT‐M IR‐Bax对细胞的增殖抑制明显小于hT ERT‐Bax。【结论】hT ERT‐M IR是胶质瘤基因靶向治疗的有效载体系统。
目的 探讨进展期结直肠癌(CRC)患者外周血人端粒酶逆转录酶(hTERT) mRNA表达量与术后复发及预后的关系.方法 以实时荧光定量RT-PCR定量检测85例进展期CRC患者根治术前、术后1个月及30例健康对照者外周血hTERT mRNA表达量;术后随访3年,CRC复发患者及未复发患者复查外周血hTERT mRNA表达量.结果进展期CRC组术前外周血hTERT mRNA表达量显著高于正常对照组[(6.22 ±5.85)2-△△Ct vs (0.45 ±0.27)2-△△Ct,P ＜0.01],术后1个月外周血hTERT mRNA表达量显著降低(P＜0.01).术后复发组外周血hTERT mRNA表达量显著高于术后1个月组和未复发组[(5.07 ±2.87)2-△△Ctvs(1.83±1.08)2-△△Ct,(2.15 ±1.49)2-△△Ct,(P＜0.01)].单因素分析显示肿瘤分化程度、肿瘤大小、淋巴结转移率及有无肝转移是影响进展期CRC患者术前外周血hTERT mRNA表达水平升高的因素(P＜0.05或P＜ 0.01).Logistic多因素回归分析显示肿瘤分化程度、淋巴结转移及肝转移为影响进展期CRC术前外周血hTERT mRNA表达升高的独立危险因素;随着术前外周血hTERT mRNA表达量的升高,CRC患者术后3年复发率逐步升高,术后生存率逐步降低.结论术前外周血hTERTmRNA表达量与进展期CRC重要病理特征相关,是影响预后的重要因素,可作为预后评价指标;术后外周血hTERT mRNA表达量升高与术后复发相关.
