目的研究白纹伊蚊对登革病毒产生细胞内免疫现象的分子机制. 方法扩增与克隆登革病毒NGC株的前膜蛋白基因prM,将prM基因以3种不同表达形式重组入昆虫表达载体pBhspEGFP,以3种重组质粒分别转染白纹伊蚊C6/36细胞,测定转染后的细胞对登革病毒感染的免疫效果. 结果构建了包含prM基因的3种昆虫表达载体,Western blot和荧光显微镜观察证明在C6/36细胞中成功表达了prM-EGFP融合蛋白.MTT实验和空斑形成实验反映了C6/36细胞对登革病毒产生了细胞内免疫. 结论 3种重组质粒均可诱导细胞内免疫现象,说明无论是否表达prM蛋白,只要有prM基因转录就可引起细胞内免疫现象;prM基因正义和反义转录形式均可诱导细胞内免疫;其形成机制可能是通过RNA干扰作用而产生.
目的对新分离乙型脑炎病毒鉴定,了解病毒E基因区段的氨基酸序列特征及基因分型. 方法 2001年在上海市采集蚊虫标本,用组织培养的方法分离到7株病毒.进行病毒一般生物学鉴定,对病毒PrM和E基因区段约2000nt进行了扩增、克隆、测序.应用Clustal X软件做碱基配对和比较分析,种系发生采用PHYLIP软件包分析. 结果 7株病毒可以引起BHK-21细胞规律病变,病变时间为60 h.乳鼠脑内接种病毒后72 h死亡.所有新分离病毒与标准乙型脑炎病毒抗体阳性反应.用病毒PrM区段(456～695位核苷酸)进行的基因分型分析,新分离的7株病毒属于基因Ⅰ型乙型脑炎病毒.以减毒活疫苗株SA14-14-2为标准,对7株病毒的E基因区段进行分析,7株病毒之间核苷酸同源性在97.7%以上,氨基酸同源性在99.2%以上;7株病毒与疫苗株SA14-14-2核苷酸差异在12.2%左右,氨基酸差异在2.8%～3.2%之间,共有14个共同的氨基酸位点差异. 结论 2001年在上海采集的蚊虫中新分离的7株病毒属于基因Ⅰ型乙型脑炎病毒,为我国的首次报道.
目的:针对登革2型病毒(DEN2)PrM基因设计新型脱氧核酶并观察其抗病毒作用.方法:根据脱氧核酶(DRz)裂解RNA靶位的特异性,选择DEN2 PrM基因中符合5'…R↓Y…3'(R=A/G,Y=U/C)特征且其二级结构中以未配对与配对碱基的磷酸二酯键为靶位,设计合成DEN2特异性脱氧核酶,筛选具有裂解PrM RNA活性的DRz.观察DRz与靶序列浓度比、Mg2+浓度及反应时间对DRz裂解效率的影响.结果与结论:体外裂解实验显示,在所设计合成的8个脱氧核酶中,DRz614对登革病毒的PrM RNA靶序列具有裂解活性,降解效率高达82%.本研究为进一步探讨新型抗登革病毒策略奠定了基础.
目的:将我国登革2型病毒PrM(D2-PrM)基因导入甲病毒载体系统,探讨含正、反义PrM基因的重组病毒对不同血清型登革病毒复制的特异抑制作用.方法:采用体外转录和电穿孔的方法,首先分别将构建的含正、反义PrM基因的重组质粒DNA和辅助载体DNA转录成RNA,然后将这两种RNA共转染BHK细胞,进而包装成重组病毒颗粒.再将经激活的重组病毒感染宿主细胞,分别用不同型登革病毒攻击,然后通过免疫荧光法,观察对不同型登革病毒复制的抑制作用.结果:含登革2型正、反义PrM基因的重组甲病毒,不仅可完全抑制该型病毒在宿主细胞中的复制,而且对其他3个型病毒的复制也具有不同程度的抑制作用.含反义PrM基因的重组病毒对4个型登革病毒复制的抑制作用最强.结论:登革2型病毒的正、反义PrM基因在宿主细胞中通过重组甲病毒,可介导对登革1～4型病毒复制的特异抑制作用.
目的 通过分析2012年重庆三峡库区蚊虫中分离乙脑病毒株PrM及E基因序列,揭示毒株的遗传特性.方法对新分离乙脑病毒的PrM及E基因进行PCR扩增,将扩增产物测序.用分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析,并绘制系统进化树.结果 新分离的8株乙脑病毒株均为基因Ⅰ型,与我国其他省市的既往分离株进化关系较近;分离株与减毒活疫苗株SA14-14-2相比较,PrM区核苷酸同源性在85.1％～86.7％之间,氨基酸同源性在95.1％～96.3％之间;E基因区核苷酸同源性在87.6％～87.8％之间,氨基酸同源性在96.9％～97.1％之间.所有新分离株与疫苗株在E基因存在14个氨基酸差异位点.结论 2012年8株重庆乙脑分离株为基因Ⅰ型,在E基因区域与疫苗株相比有部分差异.
目的 对建国后1978年广东佛山首次暴发登革热流行时从患者急性期血液中分离到的两株登革4型病毒(78-42、78-56)进行其分子特征研究并了解其可能来源.方法 用Vero细胞培养1978年分离自广东佛山登革热病人的78-42、78-56两病毒株,RNA抽提后RT-PCR法扩增prM、E区基因,克隆至pGEM-T Easy载体后测序;利用DNASTAR软件预测其氨基酸序列并与其他国内外登革4型病毒株序列比较;运用CLUSTALX1.83和MEGA3.1软件绘制系统发生树.结果 78-42、78-56两株高度同源,prM、E基因序列和氨基酸序列与其他登革4型病毒同源性很高并证实为登革4型毒株,与印度尼西亚和马来西亚分离株同属基因ⅡA亚型,核苷酸同源性与印尼ID1973株最高.结论 78-42、78-56两新分离病毒株为建国后首次分离到的登革4型毒株,其来源最可能来自印度尼西亚.
目的构建登革病毒prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6/36中表达.方法将prM基因亚克隆入真核表达载体pEGFP-N3,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆进行PCR及酶切鉴定,将获得的重组质粒以脂质体法转化白纹伊蚊C6/36细胞并使其表达,利用RT-PCR法检测目的基因的转录,Western-blot检测融合蛋白的表达.结果成功构建了pEGFP-prM重组质粒,RT-PCR证明prM基因在蚊细胞内的转录,Western-blot检测到prM-GFP融合蛋白的表达.结论成功构建登革了病毒prM基因重组表达质粒并在白纹伊蚊细胞C6/36中表达,为进一步研究细胞内免疫的分子机制及构建转基因蚊虫奠定了基础.
目的从登革病毒(NGC株)中快速分离基因组RNA,RT-PCR扩增及克隆C和prM全长基因,从而为研究蚊虫细胞对登革病毒的细胞内免疫研究奠定基础.方法以Trizol试剂从C6/36细胞培养上清中提取基因组RNA,RT-PCR扩增全长C和 prM基因,T-A重组入pGEM-T载体,重组质粒的双酶切、PCR与测序鉴定.结果与结论应用Trizol试剂从蚊细胞培养液上清中快速分离到高纯度和完整登革病毒RNA基因组,成功扩增与克隆出全长登革病毒C和prM基因.
