目的 了解感染婴幼儿的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)耐药性和耐药基因,明确检测青霉素结合蛋白2a(PBP2a)和甲氧西林耐药基因(mecA)的临床价值.方法 用金黄色葡萄球菌乳胶凝集试验和梅里埃鉴定金黄色葡萄球菌,同时用纸片扩散法完成12种常用抗生素的药敏试验.对头孢西丁的结果,按当年CLSI标准执行,用于判断菌株甲氧西林的耐药性.采用PBP2检测试剂盒检测PBP2a蛋白,PCR检测mecA基因.结果 2007-2009年婴幼儿共检出245株金黄色葡萄球菌,其中MRSA检出率为17.6%(43/245).MRSA对庆大霉素、复方新诺明、克林霉素、红霉素、氯霉素的耐药性均显著高于甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(P<0.05),其余抗生素的差异无统计学意义(P>0.05),43株MRSA的PBP2a蛋白和mecA基因的检测结果全为阳性,阳性率为100%.结论 用头孢西丁(30μg)能有效地筛查MRSA,检测PBP2a蛋白和mecA基因均能正确地确认MRSA.且检测PBP2a蛋白方便快捷,特异性好,值得临床推广.

目的 通过建立细菌双杂交技术,筛选MRSA中与PBP2a相互作用的蛋白.方法 利用PCR扩增,获得PBP2a蛋白转肽酶活性区(TPase)的编码基因,插入pRBR构建成诱饵质粒pBR-PBP2a.提取MRSA N315株基因组DNA,经Sau3AⅠ部分酶切后连接到pRAC质粒的BamHⅠ位点,获得基因组DNA表达文库;将文库质粒转化入含诱饵质粒pBR-PBP2a的报告菌株KS1,利用细菌双杂交技术进行筛选,获得与诱饵质粒编码的融合蛋白相互作用的猎物,对猎物中编码序列进行DNA测序和生物信息学分析,确定与PBP2a发生相互作用的蛋白质或多肽.结果 成功构建了pBR-PBP2a诱饵质粒,可表达PBP2a TPase与大肠埃希菌RNA聚合酶α亚单位N端序列的融合蛋白.所构建的MRSA N315株基因组文库覆盖率达9倍,满足文库筛选的需要.将文库转化含诱饵质粒和报告基因的KS1宿主菌,利用细菌双杂交技术经3次筛选,共获得9个猎物克隆,其报告基因的活性均升高2倍以上,对9个猎物质粒进行了测序,信息学分析表明它们均来自于MRSA N315株基因组,插入片段最长者648 bp,最短者334 bp, 9个插入片段中含14个编码基因,其中10个功能未知,1个编码二氢吡啶二羧酸合酶、1个编码二氢吡啶二羧酸还原酶,2个编码染色体解离稳定(SMC)蛋白.9个克隆中介导与PBP2a相互作用的多肽由14～46个氨基酸组成.结论 利用细菌双杂交技术从MRSA基因组文库中成功筛选到与PBP2a相互作用的多肽.

目的:探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin resistant staphylococcus aureus, MRSA)蛋白的体外诱导;抗MRSA-PBP2a(pencillin binding protein 2a, PBP2a)蛋白抗体的制备及效价鉴定. 方法:采用NCCLS推荐的琼脂板稀释法和PCR法筛选MRSA,以β-内酰胺抗生素作为诱导剂,进行体外诱导产生PBP2a蛋白. 免疫家兔后产生抗MRSA-PBP2a蛋白抗体,采全血分离血清, 用改良双向免疫扩散法进行抗体滴度测定. 结果:11株临床分离的金葡菌采用二种方法均检测出2株MRSA,SDS-PAGE和Western blot结果均显示从MRSA菌株中均能诱导出了PBP2a蛋白;免疫后均能产生较高的效价抗体,分别为1: 32和1: 64. 结论:成功诱导出产生耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白菌株,并制备获得PBP2a蛋白,以及制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a蛋白抗体,为研究MRSA-PBP2a蛋白活性、MRSA的免疫治疗和MRSA快速鉴定方法学的建立奠定基础.