目的:克隆SARS冠状病毒的Orf3和Orf4两个开放性读框,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析.方法:通过RT-PCR,从SARS冠状病毒基因组中扩增得到特异性片段,利用TA克隆将PCR产物克隆入PUCm-T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析.结果:RT-PCR扩增出的特异产物与预期长度相符,序列分析表明,其核苷酸序列与已发表的SARS病毒的Orf3和Orf4同源性在99%以上.结论:成功克隆SARS冠状病毒Orf3和Orf4两个开放性读框,为表达及功能研究奠定了基础.
目的 本研究通过人工合成猪附红细胞体ORF4基因,使其在大肠杆菌中高效表达.方法 选择GenBank注册的AJ504999序列的ORF4基因,应用Graphical Codon Usage Analyser选择大肠杆菌偏爱的密码子,改变基因的transl_table,设计并合成3对寡核苷酸链,用PCR-based accurate synthesis(PAS)法进行人工合成.经测序正确后,连接到表达载体PET28a,获得重组表达质粒PET28a/ORF4,导入大肠杆菌BL21(DE3),在30℃,IPTG终浓度1mmol/L的条件下诱导表达,经SDS-PAGE分析,在11 kDa附近出现目的片段.结果 结果表明ORF4基因在大肠杆菌中能够得到高效的表达,通过生物信息学软件分析表明,该蛋白存在19个配基结合位点;在21～22位氨基酸可能存在信号肽裂解位点;为胞内蛋白,没有糖基化位点.结论 ORF4基因能够在大肠杆菌中表达,推测其在M.suis蛋白质的形成,M.suis的生物功能方面有着重要的作用.
