目的:构建嵌合溶酶体相关膜蛋白(LAMP)的汉坦病毒糖基化蛋白DNA疫苗并对其免疫进行评价.方法:利用前期实验构建的重组质粒pVAX-Gn、pVAX-Gc、pVAX-LAMP/Gn和pVAX-LAMP/Gc以及inactivated疫苗免疫BALB/c小鼠,分别通过间接 ELISA 和中和试验检测免疫小鼠血清中的特异性抗体和中和抗体;攻毒实验检测小鼠体内的保护效力.结果:间接ELISA结果显示,pVAX-LAMP/Gc组特异性抗体滴度最高,依次为pVAX-Gc、pVAX-LAMP/Gn、pVAX-Gn与inactivated疫苗组;中和结果显示,LAMP组均优于相应传统DNA疫苗组,且抗体效价均优于Inactived vaccine组;攻毒实验显示,DNA疫苗和inactivated疫苗组小鼠体内无汉坦病毒特异性抗原检出.结论:LAMP分子的嵌合DNA疫苗可诱导更高水平的抗体,在小鼠体内有较好的保护效力,这一靶向策略有望成为提高DNA疫苗效价的有效方式.

目的: 构建重组表达载体P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗并接种小鼠, 评价其诱导的体液和细胞免疫应答.方法: 利用分子克隆技术, 构建重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31, 同时构建P-BAP31/EGFP和P-L-BAP31/EGFP重组质粒, 并将其以脂质体瞬时转染HeLa细胞, 通过荧光显微镜观察目的蛋白的表达;将重组质粒P-BAP31和P-L-BAP31免疫C57BL/6小鼠, 采用间接ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价;通过酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测免疫脾细胞在受到BAP31抗原刺激后产生IFN-γ和IL-4细胞因子的频率;通过乳酸脱氢酶(LDH释放)试验检测小鼠特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的应答.结果: 酶切及测序结果表明, 成功构建了针对BAP31肿瘤抗原的P-BAP31和P-L-BAP31基因疫苗.通过荧光显微镜观察重组质粒转染的HeLa细胞, 可见EGFP报告基因表达的绿色荧光.ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价发现, 带LAMP组明显高于不带LAMP组(P<0.05), 且两者均高于空质粒(P-LAMP)及正常对照(N)组(P<0.01).ELISPOT检测脾细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的频率, 带LAMP组与其他组相比显著提高(P<0.01).LDH释放试验显示, 带LAMP组的特异性CTL活性高于不带LAMP组, 且均高于对照组(P<0.01).结论: 构建了针对肿瘤抗原BAP31的全长基因疫苗, 以其免疫C57BL/6小鼠可诱导特异性体液和细胞免疫反应, 其中, P-L-BAP31基因疫苗各项免疫反应均优于P-BAP31.

目的:通过LAMP分子的靶向作用,增强截短型BAP31肿瘤抗原(BAP31)的MHC-Ⅱ提呈,激活更多的特异性CD44T细胞,最终辅助增加CTL细胞的杀伤活性及特异性抗体产生.方法:构建重组质粒P-△AP31和P-L-△AP31,同时构建重组质粒P-△AP31/EGFP和P-L-△AP31/EGFP.质粒P-△AP31/EGFP和P-L-△AP31/EGFP瞬时转染Hela细胞,荧光显微镜观察目的蛋白的表达;将重组质粒P-△AP31和P-L-△AP31免疫C57BL/6小鼠,间接ELISA检测免疫小鼠血清中特异性抗体效价;ELISPOT检测免疫脾淋巴细胞分泌细胞因子IFN-γ和IL-4的频率;乳酸脱氢酶释放法检测免疫小鼠特异性CTL反应.结果:经酶切鉴定及序列测定,成功构建截短型肿瘤抗原BAP31的DNA疫苗重组载体;用带EGFP报告基因的重组质粒转染Hela细胞,荧光显微镜观察可见特异性的绿色荧光;ELISA检测免疫小鼠血清,带LAMP组BAP31特异性抗体效价明显高于不带LAMP组(P<0.01),且两者均高于空质粒及正常对照组;ELISPOT检测分泌IFN-γ,IL-4的T细胞频率,带LAMP组明显增高(P<0.01);杀伤试验表明,特异性CTL活性带LAMP组较不带LAMP组显著提高,且均高于对照组(P<0.01).结论:构建的P-△AP31和P-L-△AP31基因疫苗不仅在小鼠体内均可诱导特异性体液和细胞免疫应答,而且P-L-△AP31基因疫苗的免疫效果显著优于P-△AP31,为进一步研制肿瘤治疗性基因疫苗奠定了基础.

目的:利用pVAX1真核表达载体构建汉滩病毒糖蛋白Gn及Gc与人溶酶体相关膜蛋白LAMP分子的重组真核表达载体,鉴定其在人真核细胞系HeLa中的表达.大量抽提去内毒素质粒,皮下注射Balb/c小鼠后初步对目标载体作为基因疫苗进行安全性评价.方法:利用PCR的方法分别以汉滩病毒编码糖蛋白M片段的cDNA为模板,扩增目的基因Gn和Gc,构建重组真核表达载体pVAX-Gn、pVAX-LAMP/Gn、pVAX-Gc和pVAX-LAMP/Gc,并进行酶切鉴定和Sanger测序.同时构建带有EGFP标签的四种重组质粒,LipofectamineTM 2000脂质体将重组质粒瞬时转染HeLa细胞,通过荧光显微镜观察结合免疫荧光检测目的蛋白的表达.抽提高纯度去内毒素的重组质粒,采用皮下注射免疫小鼠,并取重要脏器进行组织学分析.结果:双酶切鉴定和测序结果证实目的基因Gn、LAMP/Gn、Gc和LAMP/Gc成功克隆入真核载体pVAX 1,基因与原序列一致.荧光显微镜观察连有EGFP的表达载体转染的HeLa细胞,可见明显的绿色荧光,瞬时转染后特异性抗体免疫荧光检测到目的蛋白的表达.安全性评价结果显示Balb/c小鼠耐受性良好,多次注射后无明显组织形态学改变.结论:成功构建了重组嵌合载体pVAX-Gn、pVAX-LAMP/Gn、pVAX-Gc和pVAX-LAMP/Gc,并在真核细胞系中表达出目的蛋白,免疫小鼠显示了良好的安全性,为后期对汉滩病毒的靶向基因疫苗的研究奠定了基础.

目的:筛选Gn和Gc抗原优势表位,为汉滩病毒疫苗研究提供方向.方法:通过构建汉坦病毒包膜糖蛋白Gn与Gc嵌合溶酶体相关膜蛋白的DNA疫苗pVAX-LAMP/Gn,pVAX-LAMP/Gc,利用酶联免疫斑点实验(ELISpot)长期评估了BALB/c小鼠体内的细胞免疫应答.结果:在刺激T淋巴细胞的短效与长效免疫中,pVAX-LAMP/Gc组的效应优于其他组,并筛选出优势抗原表位.结论:目前许多新型汉滩病毒疫苗研究缺少细胞免疫应答评价和记忆免疫应答评价.筛选出的Gn和Gc的抗原优势表位,可以为新型汉滩病毒疫苗的研制奠定良好的基础.